熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系的生長、存活、性腺發育及生化成分的周期性變化

武祥偉 張躍環 肖 述 秦艷平 馬海濤 喻子牛

(1.中國科學院南海海洋研究所,中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室,廣東省應用海洋生物學重點實驗室,廣州510301;2.云南農業大學動物科學技術學院,昆明 650201;3.云南省高校高原漁業資源保護與可持續利用重點實驗室,昆明 650201)

海洋雙殼貝類的殼色常呈現繽紛的色彩。殼色不僅受遺傳因素的調控,還受外部環境,如浮游生物種類、水溫、鹽度、底質等的影響[1],因此,殼色與貝類的生態與行為緊密相關[2]。但最近的研究發現,殼色還與貝類的生長與存活等性狀相關聯[3—6]。因此,殼色具有成為一種可選育性狀的潛力,與經濟性狀進行協同選擇,可以培育出兼具目標殼色與經濟性狀的新品系。對殼色進行選育,首先必須明確殼色的遺傳模式。有研究認為牡蠣的殼色受單基因控制,屬于質量性狀,通過合適的選配設計可使目標殼色性狀分離,經過連續多代的選擇即可獲得純系[7,8]。目前,國內研究人員已通過多代選育成功培育出金色殼長牡蠣(Crassostrea gigas)“海大2號”[9]與黃色殼葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)“金蠣1號”[10]。

海洋雙殼貝類營養成分的含量多寡與性腺發育和配子發生密切相關,影響著性腺發育的程度及配子發生的快慢[11,12]。糖原和甘油三酯是牡蠣配子形成過程中卵黃生成所需的主要物質,蛋白質亦是餌料匱乏時性腺發育所需能量的主要來源,對牡蠣的配子發生、成熟與排放起到重要作用[13]。本研究以熊本牡蠣金色殼品系和黑色殼品系F3群體為研究對象,比較了兩個品系生長與存活率的差異及與殼色的相關關系,并進一步確認了性腺發育特征及配子發生與生化成分含量的關系。本研究為熊本牡蠣殼色品系的選育提供了依據。

1 材料與方法

1.1 金色殼與黑色殼品系的構建與培育

以2015年構建的熊本牡蠣殼金品系、殼黑品系的F2群體為親本,采用截頭法分別選擇200個個體(雌∶雄=3∶1)構建F3群體,留種率為10%,選擇強度為1.755[14]。人工解剖獲取精卵,并使用新鮮海水促熟卵子與激活精子后備用。

采用人工授精,受精卵密度為5×107個/L,孵化條件: 溫度27—30℃,鹽度20,pH 7.8—8.5。在室內進行浮游幼蟲培育;采用成吊的牡蠣殼作為附著基,幼蟲變態并附著完畢后轉移至廣西北海自然海區吊養,進行稚貝與成貝的培育。室內幼蟲培育與室外成貝養殖過程中養殖密度調節至相同。實驗重復3次。

1.2 性狀測量

使用顯微鏡(Olympus CX22,Tokyo,Japan)測量9、12和15 dph (day post hatching)浮游幼蟲的殼高(μm);使用游標卡尺(精確至0.01 mm)測量40日齡稚貝的殼長與殼高(mm),以及180、360、450 dph成貝的殼長、殼高(mm)。每次測量60個個體。

測量180、360、450 dph成貝的總體積,方法為: 1 mL淡水的重量為1 g,因此總體積定義為同體積淡水的重量。使用量筒或燒杯盛滿淡水,把整只牡蠣放入其中,收集溢出的淡水并稱重(g),即為總體積(mL)。

測量180、360、450 dph成貝的總重,方法為:使用天平稱量牡蠣總重(精確至0.01 g);牡蠣開殼后用濾紙吸干體腔液,稱量軟體重(精確至0.01 g)。

計算9、12、15 dph浮游幼蟲的存活率,方法為: 使用300目篩絹網隨機收集幼蟲,濃縮至1.5 mL離心管中顯微鏡下統計空殼數與幼蟲數,存活率為幼蟲數占總數量的百分比。

計算40、180、360、450 dph的成活率;方法為: 在每個時間點隨機各采集3吊牡蠣(約120個個體),統計空殼數與活體數,成活率為活體數占總數的百分比。

1.3 性腺發育分期與性別鑒定

金色殼與黑色殼品系分別在180(2016年12月)、360(2017年6月)、450(2017年10月) dph取樣,每次隨機采集60個個體制作石蠟切片。解剖后取性腺組織(去除消化腺),固定于Bouin’s液中,24h后轉入70%乙醇溶液中,之后依次進行脫水、透明、包埋,并做連續切片,切片厚度6—8 μm。將切片置于45℃恒溫箱中烘干后進行蘇木精-伊紅(HE)染色。

使用顯微鏡觀察性腺切片,參照已報道方法[15,16]鑒定性腺發育階段,本研究把牡蠣性腺發育分為6個時期: 未分化期、形成期、生長期、成熟期、排放期、耗盡期,每期特征為: 未分化期: 濾泡長條形,較薄,生殖細胞緊貼濾泡壁,不能辨別雌雄。形成期: 生殖細胞(精原細胞、卵原細胞)開始形成,濾泡開始增大。生長期: 濾泡較大,濾泡壁處具有較多的精原細胞或卵原細胞,濾泡腔中可出現少量精細胞或卵黃形成前期的卵母細胞,可辨別雌雄。成熟期: 性腺飽滿,濾泡緊密相連,內充滿多邊形的卵子或輻射狀排列的精子,但無排卵或排精現象。排放期: 卵子或精子大量排入生殖導管中,濾泡內出現較大空白空間。耗盡期: 卵巢中殘存少量扁塌的卵子,處于重吸收狀態,濾泡壁上有少量不連續的生殖細胞,如卵原細胞或精原細胞。

通過生殖細胞的有無和類型辨別每個個體的性別,把個體的性別分為未分化、雌性、雄性、雌雄同體等四種類型。

1.4 生化成分定量

分別在180、360、450 dph取樣,每次每個品系隨機采集15個個體,解剖后分別取性腺(去除消化腺)、閉殼肌、鰓、外套膜,每5個個體的4種組織分別混合,每種組織制成3個混合樣品保存于-80℃備用。

采用二喹啉甲酸法測定總蛋白含量[17],即準確稱取1 g組織,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,冰浴條件下勻漿,2500 r/min離心10 min,取上清液待測。使用酶標儀比色法,以雙蒸水作為空白對照,標準品濃度為563 μg/mL,讀取波長562 nm處的吸光度,按照總蛋白濃度(μg/mL)=(待測樣OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×待測樣稀釋倍數,計算總蛋白含量。

采用磷酸甘油氧化酶法(GPO-PAP)測定甘油三酯含量[18],即組織勻漿后制成待測液,使用酶標儀比色法,以雙蒸水作為空白對照,標準品濃度為2.26 mmol/L,讀取波長500 nm處的吸光度。按照甘油三酯含量(mmol/g prot)=(待測樣OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度/待測樣本蛋白濃度(g/L),計算甘油三酯含量。

采用蒽酮法測定糖原定量[19]。取新鮮組織,使用生理鹽水漂洗后再用濾紙吸干水分,稱重,并按照樣本重(mg)∶堿液體積(μL)為1∶3的比例向樣本中加入堿液,沸水煮沸20min,流水冷卻后制成待測液,并按照5%的待測液濃度加入蒸餾水。取1 mL檢測液加入1 mL顯色劑,沸水浴5min,冷卻后以雙蒸水為空白對照,標準品濃度為0.01 mg/mL,使用分光光度計讀取波長620 nm處的吸光度(1 cm光徑),按照糖原含量(mg/g組織)=待測樣OD值/標準OD值×標準品含量×待測樣稀釋倍數×10/1.11計算糖元含量。

1.5 數據分析

使用SPSS18.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)計算每組數據的平均值與標準差(Mean±SD),采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢測組間的差異顯著性,水平均為P＜0.05。

2 結果

2.1 浮游幼蟲與稚貝的生長比較

9—40 dph殼金品系的殼高均小于殼黑品系,差異顯著(P＜0.05,15 dph除外)。殼金品系在浮游幼蟲期無生長優勢(表1)。

2.2 幼貝與成貝生長比較

180—450 dph,殼金品系的殼高、殼長、總重、總體積、軟體重均大于殼黑品系,總重呈顯著性差異(P＜0.05,表2),表明在幼貝與成貝階段,殼金品系具有較全面的生長優勢。

表 1 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系9—40 dph的殼長與殼高Tab.1 Shell length and shell height of golden shell and black shell lines from 9 to 40 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

注: 同列數據上標不同表示差異顯著 (P＜0.05);下同Note: Values in each column with different superscripts are significantly different (P＜0.05).The same applies below

品系Line 9日齡9 dph 12日齡12 dph 15日齡15 dph 40日齡40 dph殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (mm) 殼長Shell length (mm)殼金Golden shell 170.04±20.71b 264.88±47.68b 340.91±39.56a 9.88±1.17b 8.06±0.94a殼黑Black shell 211.74±42.76a 331.26±47.85a 347.07±46.81a 11.15±1.30a 9.27±1.43a

表 2 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系180—450 dph的生長Tab.2 Growth of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

表 2 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系180—450 dph的生長Tab.2 Growth of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

品系Line 殼高 Shell height (mm) 殼長Shell length (mm) 總重Total weight (g) 總體積Total volume (mL) 軟體重Body weight (g)180 dph(2016年12月) 180 dph (December 2016)殼金Golden shell 43.92±6.77a 31.61±6.20a 10.94±3.81a 6.02±2.17a 2.36±0.90a殼黑Black shell 38.83±7.65b 26.47±5.91b 7.13±3.70b 4.35±2.45b 1.32±0.76b 360 dph(2017年6月) 360 dph (June 2017)殼金Golden shell 50.99±9.42a 34.87±6.99a 23.53±4.76a 15.58±2.95a 4.12±0.88a殼黑Black shell 50.12±8.95a 37.97±6.39a 19.41±8.74b 12.04±5.38b 3.86±1.74a 450 dph(2017年10月) 450 dph (October 2017)殼金Golden shell 56.56±10.94a 39.36±8.27a 30.28±12.33a 18.71±7.62a 4.83±1.84a殼黑Black shell 57.57±6.24a 38.68±5.25a 27.33±8.79b 17.50±5.81a 4.17±1.83a

2.3 成貝存活率差異比較

熊本牡蠣浮游幼蟲期(9—15 dph)、稚貝期(40 dph)與幼貝期(180 dph)殼金品系的存活率高于殼黑品系,但無顯著性差異(P＞0.05)。360 dph與450 dph(2017年6月與10月)殼金品系的成活率分別為55.35%與42.22%,是殼黑品系成活率(分別為25.23%與12.09%)的2.19倍與3.49倍,差異顯著(P＜0.05)。殼金品系在成貝期具有較高的存活率優勢(表3)。

2.4 性別比例

180—450 dph殼金品系與殼黑品系性別比例同步變化。180、360與450 dph殼金品系的雌雄比分別為1∶0.56、1∶0.45與1∶0.9,180與360 dph時19%與4%的個體具有未分化性腺。而相同時間殼黑品系的雌雄比分別為1∶1.7、1∶0.27與1∶0.28,僅在180 dph時存在15%的未分化個體(圖1)。

2.5 性腺發育特征

180—450 dph殼金品系與殼黑品系的性腺發育具有同步性(圖2)。180 dph殼金品系與殼黑品系處于性腺分化期的個體比例分別為47.6%與53.5%,處于成熟期和排放期的個體比例分別為14.3%與7.1%;而360 與450 dph時90%以上的個體均處于成熟期、排放期或耗盡期(圖3)。

2.6 生化成分含量變化

180—450 dph殼金與殼黑品系的糖原含量均逐漸升高,而甘油三酯含量逐漸降低;并且殼金品系的糖原含量與甘油三酯含量大于殼黑品系,但無顯著性差異(P＞0.05,圖4)?？偟鞍缀吭诓煌M織和不同時期無顯著變化(圖4)。

表 3 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系第9到第450 dph的存活率Tab.3 Survival rate of golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea in 9 to 450 dph

圖1 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系(a)與殼黑品系(b)的性別比例Fig.1 Sex ratio of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea

圖2 熊本牡蠣殼金與殼黑品系性腺發育分期Fig.2 Gonad developmental stages for golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea

3 討論

3.1 殼色對生長與存活的影響

海洋雙殼貝類普遍具有殼色多態性現象,淺色殼個體具有較高的基因純合度,但亦表現較低的適合度[6]。殼色與經濟性狀常存在顯著的相關性。同時期的長牡蠣殼白色群體軟體重與存活率均低于深殼色群體[20]。長牡蠣中亦發現殼金色與殼紫色群體幼蟲的殼高顯著高于殼白色群體(P＜0.05),成貝階段殼金色群體的生長亦顯著大于殼白色與殼黑色群體,并且殼紫色群體的存活率顯著高于其他殼色的群體[21]。進一步研究表明,長牡蠣貝殼的金黃色是一種背景色,為單基因控制的顯性性狀,可以穩定遺傳[8];不同殼色個體生長與存活的差異性可能是由于有害隱性等位基因純合導致生長速度下降[5,22]。在本研究中熊本牡蠣不同殼色群體中亦發現相似現象,殼金品系成貝的生長與存活率均高于殼黑品系,并且在幼貝與成貝期殼金品系的殼高、殼長、總重、總體積與軟體重均大于殼黑品系。同時,熊本牡蠣成貝的存活率與殼色亦顯著相關,6月與10月殼金品系的存活率是殼黑品系的2.19倍與3.49倍。因此,熊本牡蠣殼金品系表現出顯著的生長優勢與存活優勢(P＜0.05)。

圖3 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系(a)與殼黑品系(b)的性腺發育特征Fig.3 Gonadal development for golden shell (a) and black shell(b) lines of Crassostrea sikamea from 180 to 450 dph

圖4 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系閉殼肌、外套膜、鰓和性腺中糖元、甘油三酯和總蛋白含量的變化Fig.4 Contents of glycogen,triglyceridy and total protein contents in the adductor muscle,mantle,gill and gonad in golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea from 180 to 450 dph

3.2 性腺發育周期

外源性因素是影響牡蠣性腺發育的重要因素,包括水溫、鹽度、餌料生物多寡等[23]。水溫是變化較大的外部因素,水溫通過影響新陳代謝速率從而影響配子發育和產卵等生殖活動,水溫升高新陳代謝加快,通過供給性腺充足的能量來促進性腺生長[24]。即使在沒有繁殖活動的冬季,人為升高海灣扇貝(Argopecten irradians)養殖水溫5—20℃,均可促使其生殖腺的發育成熟[25]。在本研究中180 dph(2016年12月)殼金與殼黑品系僅分別有14.3%和2.8%的個體處于性腺成熟期,約50%的個體性腺仍處于生長期。熊本牡蠣殼金與殼黑品系養殖于廣西北海自然海區,12月份水溫最低。因此,較低的水溫是推遲性腺成熟的原因之一。本研究中殼金與殼黑品系全年只有一個繁殖期,在6—10月份為繁殖盛期,這種性腺發育特征與長牡蠣殼金群體以及魁蚶的性腺發育相似[11,26]。

3.3 生化成分含量周期性變化

糖原和甘油三酯是牡蠣配子形成過程中卵黃生成所需的主要物質[27]。在本研究中殼金與殼黑品系的糖原與甘油三酯含量在性腺中最高,并隨著配子生成與性腺發育成熟而增減,表明糖原和甘油三酯與熊本牡蠣繁殖相關。糖原是牡蠣配子形成過程中的主要供能物質,配子發育成熟需要大量的能量,一旦發育成熟,能量需要即減少[28]。180—450 dph(12月—次年10月)熊本牡蠣殼黑品系性腺中糖元含量在6月(360 dph)最高,之后逐漸降低,而在殼金品系性腺中糖元含量一直升高,可能表明熊本牡蠣殼金品系比殼黑品系具有更長的繁殖期。同時,殼金與殼黑品系性腺中甘油三酯含量均逐漸降低。脂質是卵子的重要組成成分,甘油三酯是脂質積累所需的主要物質,隨著卵子大量成熟并排放,脂質積累完成,甘油三酯需求減少,性腺中甘油三酯含量逐漸降低[27]。在長牡蠣殼金品系以及菲律賓綴錦蛤(Tapes philippinarum)性腺的發育過程中亦發現甘油三酯含量隨性腺發育成熟而減少的現象[11,29]。蛋白質是貝類卵黃的重要組成部分,是精巢發育的能量來源,卵子發生過程中蛋白質在卵細胞中積累,并隨卵子排放而在性腺中的含量快速降低[30,31]。冬季牡蠣餌料匱乏時蛋白質亦是主要的供能物質[13]。但在本研究中殼金與殼黑品系總蛋白含量無組織與時間差異性。熊本牡蠣性腺在發育過程中可能具有不同的蛋白代謝方式。

總之,熊本牡蠣殼金品系具有生長優勢與存活率優勢;兩個品系之間的性腺發育具有同步性,性腺中糖原和甘油三酯的含量高低與性腺發育周期密切相關。殼金品系與殼黑品系為熊本牡蠣選擇育種提供了有用的素材。