Fe3O4@Au模擬酶快速檢測亞硫酸鹽的研究

關樺楠，宋巖，劉博，韓博林，龔德狀，彭博，張娜

(哈爾濱商業大學 食品工程學院，哈爾濱 150076)

亞硫酸鹽是食品加工領域的必需品，具有貯藏保鮮、殺菌、漂白、增酸等作用，在食品工業中常用作防腐劑以抑制酶促和非酶促褐變，并且在釀造工業中用作抗菌劑和抗氧化劑[1-3]。作為一種傳統的食品添加劑，亞硫酸鹽在新鮮的水果和蔬菜、果脯、果汁、葡萄酒、淀粉類產品以及海產品的工業化生產中具有廣泛的應用，可延長食品的貯藏時間，確保許多加工食品和飲料的營養充足性、適口性和安全性[4-6]。自20世紀以來，亞硫酸鹽的安全問題就已經引起人們的重視。亞硫酸鹽是一種常見的過敏原，易引發過敏反應。它能與蛋白質巰基進行反應，過量攝入或長期攝入會對機體造成一定的損傷。而在其使用過程中釋放的二氧化硫對機體的多種器官均有毒理作用，是一種全身性毒物[7,8]。因此，我國及世界其他國家和組織都制定了亞硫酸鹽在食品加工過程中的限量標準[9]。但在實際加工生產中，人為添加劑量過大甚至濫用亞硫酸鹽防腐劑的現象仍時有發生，極易對人體神經、呼吸及消化系統產生危害[10]。在食品加工領域，亞硫酸鹽的毒性作用不可忽視，因此建立有效的檢測方法就顯得尤為重要。目前，應用于食品中亞硫酸鹽檢測的方法主要有離子色譜法、電化學傳感器及熒光分析法[11-14]，具有靈敏度高、檢測限低、可靠性強等優勢，但存在前處理復雜和需要大型儀器等缺點，無法實現現場快速檢測[15]。因此，針對亞硫酸鹽建立簡單、快速和精準的可視化檢測體系具有重要的應用價值和實際意義。

Fe3O4@Au納米微粒具有模擬過氧化物酶活性，能夠有效地催化ABTS產生顯色反應[16]。與天然酶相比，具有制備簡單、成本低廉、穩定性高、催化性能可調控等優點，可替代天然酶應用于酶法食品分析及食品安全快速檢測[17]。本課題組曾報道了金磁微粒模擬酶用于食品中葡萄糖的比色檢測[18]。試驗設計了一種基于Fe3O4@Au納米微粒催化特性的亞硫酸根快速檢測方法，利用亞硫酸根離子具有較強的還原性，可使氧化的顯綠色的ABTS+褪色為ABTS的原理來實現對亞硫酸根的比色傳感檢測。試驗中建立了最優的比色傳感體系，探討了體系的抗干擾性，為實現食品中亞硫酸鹽的快速定量檢測提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鐵(FeCl3·H2O)、醋酸鈉(NaAc·3H2O)、無水醋酸鈉、冰醋酸、PEG-4000、氯金酸、過氧化氫：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙二醇：天津市華東試劑廠；乙醇：上海振興化工一廠；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：國藥集團化學試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)：淮安和元化工有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FC204型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；YZHR-25型水熱反應釜 上海耀冠儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；H-113ATC型分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；VSM LDJ 9600型振動磁強計 北京翠海佳誠磁電科技有限責任公司；Advanced-D8型X-射線粉末衍射儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備

將1.35 g的FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，依次加入3.6 g的NaAc·3H2O與1.0 g PEG-4000，形成均一的溶液，再攪拌30 min。向水熱反應釜中倒入攪拌后的溶液，200 ℃保持8 h，結束后冷卻至室溫，所得黑色的產物用乙醇和水各洗滌3次。

1.3.2 金納米粒子的綠色制備

將10 g新鮮橘子皮粉碎后浸泡于100 mL的去離子水中，再將浸泡液于4000 r/min條件下，離心3 min后取上清液。此上清液作為工作液，于冰箱4 ℃條件下保存。在室溫條件下啟動磁力攪拌器，在燒杯中加入20 mL提前4 ℃預冷的氯金酸溶液中(1%，W/V)，溫和攪拌。待2 min后，迅速加入5 mL預先制備的橘皮浸泡工作液，并立即觀察有無顏色上的變化，即由黃色變成紫色后再變為酒紅色，當變為酒紅色時，提高攪拌速度，10 min后制得金納米粒子，隨即將其置于冰箱4 ℃條件下保存。

1.3.3 金磁微粒的制備

取2 g合成的Fe3O4納米微粒超聲分散在50 mL含有20%乙醇水溶液中，室溫條件下，邊攪拌邊緩慢滴加1 mL APTES，7 h后得到淺棕色帶細微顆粒的懸濁液即為反應結束，產物即為氨基化修飾后的Fe3O4納米微粒。此產物用0.1 mol/L的HCl-乙醇溶液磁分離清洗3次，烘干后備用。取上述制備的氨基修飾的Fe3O4納米微粒2 g于室溫下150 r/min攪拌中迅速加入20 mL所制備的金納米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐漸變淡，低速攪拌反應12 h后，獲得金磁微粒Fe3O4@Au。

1.3.4 表征

將制備的磁性材料粉末用適量的蒸餾水稀釋，置于超聲波清洗器上超聲振蕩使其均勻分散。采用X-射線粉末衍射儀對Fe3O4@Au結構進行表征，在室溫下通過振動磁強計測量Fe3O4@Au的磁學性能。用適量的蒸餾水稀釋磁性材料的合成粉末并使其均勻并通過超聲波清洗分離。Fe3O4@Au的結構用X射線粉末板表征，Fe3O4@Au的磁性能在室溫下由振蕩器測量。

1.3.5 單因素優化金磁微粒檢測亞硫酸根的體系

體系中加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL的H2O2(0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 mol/L)，200 μL 的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應體系放置于(30，40，50，60，70 ℃)水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處打的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.01 mol/L)反應(5 s、10 s、30 s、1 min、2 min)測定420 nm處的吸光度。重復試驗3次，計算反應前后吸光度差值。

1.3.6 正交試驗設計優化檢測體系

根據正交設計表選擇 L9(34)正交試驗，體系中加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL不同濃度的H2O2，200 μL的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應體系放置于不同溫度的水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.01 mol/L)反應不同時間后測定420 nm處的吸光度。重復試驗3次，計算反應前后吸光度差值。確定因素影響的主次順序及優選方案。

1.3.7 亞硫酸根檢測體系工作曲線、檢測限、回收率和選擇性的測定

在最適濃度、最適溫度、時間體系下，加入3 mL HAc-NaAc 緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.4)，500 μL的H2O2，200 μL 的ABTS溶液(25 mmol/L)，100 μL的納米Fe3O4@Au粉末混懸液(0.1 g/mL)，將反應體系放置于水浴鍋中，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉一次)取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處的吸光度，再加入200 μL亞硫酸鈉溶液(0.001，0.0025，0.005，0.0075，0.01，0.02 mol/L)反應后測定420 nm處的吸光度。重復試驗3次，計算反應前后吸光度差值。根據不同濃度亞硫酸根與吸光度值差值繪制標準曲線，計算最低檢出限和回收率。在正交試驗優化的條件下向檢測體系中分別添加0.2 mol/L的PO34-、SO42-、Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+、K+作為對比體系進行反應，掃描體系的紫外-可見光吸收光譜。

1.4 數據處理

試驗數據采用DPS 軟件處理，并采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 金磁微粒的表征

對所制備的Fe3O4納米粒子用硅烷偶聯劑APTES進行表面改性，APTES改性的目的是在磁性粒子的表面形成一層分子結合劑。在介孔孔道中引入帶正電荷的氨基，有利于中和反應機制的進行，并能利用靜電力、氫鍵的相互作用有效提高對金納米粒子的吸附能力[19]。

由圖1可知，基于JCPDS 19-0629卡，衍射峰(111)和(311)對應Au；衍射峰(220)、(311)、(400)、(511)、(422)和(440)對應Fe3O4，說明該微粒中含有Au和Fe3O4。其中，(111)和(311)對應的衍射峰2θ為38.56°和77.58°，基于JCPDS 80-3697卡，結果表明Fe3O4@Au中所負載的金納米粒子為催化裂化型晶格，有助于提升金磁微粒的催化性能。Fe3O4衍射峰所對應的2θ為30.17°、35.54°、43.27°、53.62°、57.11°、62.85°，基于JCPDS 19-0629卡，結果表明Fe3O4@Au中的Fe3O4為立方反尖晶石結構，具備較好的磁電性能。

圖1 金磁微粒X-射線衍射圖譜Fig.1 X-ray diffraction map of gold magnetic particles

由圖2可知，氨基化Fe3O4和Fe3O4@Au的磁學性質分析結果表明，飽和磁化值分別為78 emu/g和59 emu/g，說明金納米粒子的吸附弱化了磁核的磁性。包覆Au的含量升高會導致復合微粒磁化強度的輕微降低，這一結論和其他同類磁性納米復合微粒的磁學性質一致[20]。磁學性質分析結果表明，氨基化作用后其依然具有超順磁性，磁飽和強度值(M)為 43 emu/g，說明氨基化作用不會顯著影響磁球的超順磁性特點。與納米Fe3O4相比，氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和，可有效防止納米磁球聚合，使得納米磁球能夠穩定地分散在水溶液中。

圖2 氨基化Fe3O4和金磁微粒的磁滯回線Fig.2 The hysteresis loop of aminated Fe3O4 and gold magnetic particles

2.2 不同催化條件對Fe3O4@Au模擬酶檢測體系的影響

2.2.1 過氧化氫濃度對檢測體系的影響

由圖3可知，過氧化氫的濃度對模擬酶檢測亞硫酸根體系有直接影響。H2O2濃度在0.005～0.05 mol/L范圍內時，吸光度差值隨H2O2濃度的增加呈快速上升趨勢。H2O2濃度在0.05～0.1 mol/L時，隨H2O2濃度的增加，吸光度差值處于緩慢增加階段。H2O2濃度在0.1～0.5 mol/L范圍內時，體系中H2O2濃度較高，SO32-被消耗，用來還原ABTS+的離子減少，吸光度差值呈下降趨勢。由此可知，H2O2濃度在0.1 mol/L時檢測效果最好。因此，H2O2濃度因素選擇0.05，0.1，0.5 mol/L這3個水平進行正交試驗。

圖3 過氧化氫濃度對檢測體系的影響結果Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on detection system

2.2.2 催化溫度對檢測體系的影響

由圖4可知，溫度在30～60 ℃范圍內，隨著催化溫度不斷升高，吸光度差值呈上升趨勢。在固定化溫度為60～70 ℃以后，吸光度差值緩慢平穩上升，表明隨著溫度的升高，模擬酶的催化活性增強，溫度越高檢測效果越好?？紤]到過高溫度不適用于即時檢測，以及在60 ℃以后體系的反應速率變緩，因此，催化溫度因素選擇吸光度差值最好的3個水平50，60，70 ℃進行正交試驗。

圖4 催化溫度對檢測體系的影響結果Fig.4 Effect of catalytic temperature on detection system

2.2.3 反應時間對檢測體系的影響

由圖5可知，反應時間在5～10 s時，隨著反應時間的延長，吸光度差值呈上升趨勢。時間在10～60 s時，吸光度差值呈緩慢平穩下降趨勢。反應時間在60～120 s時，吸光度差值呈快速下降趨勢。結果表明，當H2O2濃度和催化溫度相同時，在5～10 s內，反應時間越長，亞硫酸根檢測效果越好。在10～60 s范圍內檢測速率變慢，檢測效果基本達到最優，過長的反應時間不利于快速檢測，因此10 s為最優反應時間，反應時間因素選擇10，30，60 s這3個水平進行正交試驗。

圖5 反應時間對檢測體系的影響結果Fig.5 Effect of reaction time on detection system

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，采用L9(34)正交試驗表進行正交實驗，對Fe3O4@Au模擬酶催化體系進行正交試驗優化，結果見表1。

表1 正交試驗設計及結果分析Table 1 Analysis of orthogonal experiment design and results

由表1極差分析結果可知，3個因素對Fe3O4@Au模擬酶催化體系的影響由大到小依次為H2O2濃度(A)>催化溫度(B)>反應時間(C)。在正交試驗設計范圍內，得到Fe3O4@Au模擬酶催化體系的優化條件為A2B3C3，即H2O2濃度為0.1 mol/L，催化溫度為70 ℃，反應時間為60 s。綜合上述分析，可以說明H2O2濃度是影響檢測體系的主要因素，催化溫度和反應時間對反應體系也有相應的影響。

2.4 亞硫酸根檢測體系的響應效果

2.4.1 最低檢出限及回收率

對不同濃度的亞硫酸根做工作曲線，結果見圖6。

圖6 亞硫酸根檢測體系工作曲線Fig.6 Standard curve of sulfite ion detection system

在最優反應條件下，反應體系在420 nm處吸光度的降低程度ΔA(y)與亞硫酸根的濃度c(x)成正比，亞硫酸根濃度在 0.001～0.02 mol/L范圍內具有良好的線性關系，其線性方程為 y=67.652x+0.0713(R2=0.9872)，檢測限為1.47 μmol/L，樣品回收率為95.26%～110%。

在相同反應體系下，定量檢測0.01，0.005 mol/L亞硫酸根溶液的吸光度值，帶入工作曲線回歸方程，樣品回收率分別為95.20%和102.36%，說明建立的檢測方法符合檢測準確度和重復性的要求。

2.4.2 檢測體系選擇性研究

選擇性是比色檢測體系的重要指標。試驗過程考察了檢測體系的選擇性，結果見圖7。

圖7 亞硫酸根檢測體系的選擇性Fig.7 Selectivity of sulfite ion detection system

亞硫酸根檢測體系與其他干擾離子檢測體系的差異度非常顯著，PO34-、SO42-、Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+、K+基本不干擾亞硫酸根離子的測定，說明該模擬酶檢測亞硫酸根的體系具有較高的檢測特異性，不需要掩蔽這些離子。

3 結論

本文以Fe3O4@Au納米材料作為過氧化物模擬酶建立一種靈敏度高、選擇性好的亞硫酸根快速比色檢測方法。將使用APTES氨基化修飾的磁性Fe3O4微粒和金納米粒子采用組裝法制備Fe3O4@Au復合材料，利用其催化活性建立亞硫酸根檢測體系，探求體系最優工藝組合，評估體系檢測性能。結果表明：氨基化后的Fe3O4納米粒子負載金納米粒子有助于提高金磁微粒的催化性能，基于其過氧化物模擬酶的活性建立的亞硫酸根檢測方法特異性好、準確且可重復。該研究使現場快速可視化檢測亞硫酸根的方法變得更加多元，為實際樣品中亞硫酸根的檢測奠定了基礎。