酶底物法與過濾培養法檢測非飲用水中嗜肺軍團菌的比較

高 艷，李 嘯，段 杉，劉 丹，顧 琳，趙劍虹，孫靈利

(北京市朝陽區疾病預防控制中心，北京 100021)

現代社會人們生活在密閉空間的時間不斷增加，受到室內環境病原微生物感染的風險也隨之增高。近幾年，由嗜肺軍團菌引起的軍團菌病(Legionnaires′ disease，LD)的數量急速上升，引起世界各國的高度重視[1-2]。軍團菌病是一種嚴重的潛在致命性肺炎，主要由吸入的嗜肺軍團菌污染的霧化水引起[3]。軍團菌主要在溫水中繁殖并存活，與人造水系統有關，包括冷卻塔、建筑用水、漩渦水療和裝飾性噴泉等。許多國家出臺了水環境中的嗜肺軍團菌監測方案，作為防止軍團菌病暴發流行的重要控制環節[4-7]。

我國原衛生部于2006年頒布了《公共場所集中空調通風系統衛生規范》的行業標準，依據該標準，各級疾控部門和監督部門相繼開展了公共場所集中空調嗜肺軍團菌的監測、評價和調查工作。2013年，中華人民共和國國家標準《公共場所衛生檢驗方法》(GB/T 18204.5—2013)[8]出臺，其中，第5部分介紹了集中空調冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團菌的檢測方法。上述行業標準與國家標準對集中空調冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團菌的檢測方法基本相同，且與歐美等國家監測方法相似[9-10]，即通過對集中空調冷凝水、冷卻水進行過濾、洗脫、酸處理、熱處理后進行細菌培養。該方法需要多種儀器，且耗材種類繁多，流程復雜，須由多名試驗人員共同完成，具有較高的試驗成本。

近年來出現了幾種新的嗜肺軍團菌定量檢測方法，其中，酶底物法是嗜肺軍團菌利用酶底物試劑中氨基酸、維生素和其他營養物質迅速生長和增殖，其代謝產物與試劑發生反應使溶液顯褐色，基于最可能數(most probable number，MPN)方法對樣本中嗜肺軍團菌進行定量分析。2018年，北美、歐洲開始相繼應用該方法在飲用水和非飲用水中檢測嗜肺軍團菌[11-14]。目前，我國還未對該方法進行評價。

本研究應用我國GB/T 18204.5—2013[8]推薦的過濾培養法與酶底物法同時對本地區公共場所非飲用水中嗜肺軍團菌進行檢測。對檢測結果進行統計分析，比較兩種方法的優點和不足，探討酶底物法應用于非飲用水中嗜肺軍團菌檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

84件非飲用水樣本采集于2019年8月—10月朝陽區24家公共場所。樣本包括集中空調冷凝水9件，冷卻水55件，淋浴水20件。樣品采集方法依據GB/T 18204.5—2013[8]。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Quanti-tray plus程控定量封口機(IDEXX)，六聯不銹鋼微生物過濾系統(Sartorius)，羅氏LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.2.2 試劑

GVPC瓊脂平板、BCYE瓊脂平板、L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，購于OXOID公司。嗜肺軍團菌乳膠凝集試劑 Lp-1型、Lp2-14型，購于OXOID公司。嗜肺軍團菌生化鑒定試劑盒，購于環凱微生物。嗜肺軍團菌核酸檢測試劑盒，購于江蘇碩世。Legiolert試劑、預處理試劑、Legiolert定量盤，購于IDEXX公司。

1.3 方法

1.3.1 酶底物法

(1)樣本處理與培養

根據Legiolert說明書進行。在無菌微管中加入1 mL Legiolert預處理液及1 mL樣品，渦旋混勻后室溫下溫育1 min，轉移至100 mL溶解的Legiolert試劑中，充分混合并倒入Legiolert定量盤，用SealerPlus程控定量封口機密封。

將密封好的Legiolert定量盤紙側向下置于(37±0.5)℃培養箱中，培養7 d。7 d后，定量盤中棕色孔或渾濁孔即為陽性孔。

(2)陽性孔確證試驗

為了檢驗酶底物法的特異性，對Legiolert定量盤中陽性孔進行確證試驗。Legiolert定量盤共有6個大孔，90個小孔。如果陽性孔數小于10個，全部進行確證；如果陽性孔數大于10個，先選取10個(包括全部大孔及隨機選取的小孔)，再加上隨機選取剩余陽性孔數的25%進行確證。確證方法為使用無菌注射器抽取10 μL懸浮液，涂布BCYE和L-半胱氨酸缺失的BCYE，35～37 ℃培養48～72 h，在BCYE上生長、L-半胱氨酸缺失的BCYE上無生長的菌落進行生化鑒定、血清型別鑒定及real-time PCR鑒定。

(3)酶底物法的計量結果

酶底物法采用MPN法確定樣本中嗜肺軍團菌含量，計算陽性大孔和小孔的數目，并從Legiolert MPN表獲得所得的MPN值。MPN是應用概率理論來估算細菌濃度，實際菌落數有可能落在置信區間內的任何一點，MPN值是落在這個置信區間內概率最大的一點。

1.3.2 過濾培養法

(1)過濾、洗脫、前處理

依據GB/T 18204.5—2013[8]，使用六聯不銹鋼微生物過濾系統對非飲用水樣本進行過濾處理。抽濾完成后，取下濾膜置于15 mL滅菌水中充分洗脫，洗脫液在培養前進行酸處理與熱處理。

(2)接種與培養

取酸處理樣品、熱處理樣品各0.1 mL接種GVPC。于35～37 ℃、2.5% CO2環境中培養10 d。24 h內長出的為非嗜肺軍團菌，24 h后長出的為可疑嗜肺軍團菌，繼續鑒定。

(3)菌落驗證

選取可疑菌落，如果數量小于10個則全部選??；如多于10個，則選取10個及超過10個數量的25%。將選取菌落接種BCYE和L-半胱氨酸缺失的BCYE，35～37 ℃培養48 h，在BCYE上生長、L-半胱氨酸缺失的BCYE上無生長的菌落繼續進行生化鑒定、血清型別鑒定及real-time PCR鑒定。

(4)結果判定

定性結果：酸處理與熱處理后的培養結果，只要有一種方法培養出嗜肺軍團菌，即判斷該樣本含有嗜肺軍團菌。

定量結果：酸處理與熱處理后的培養結果，選取菌落數量較大值為該樣本定量結果。

1.4 質量控制

ATCC33152為本次研究質控菌株。

1.5 統計分析

數據采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。采用origin 繪圖軟件進行繪圖。嗜肺軍團菌陽性率組間比較采用卡方檢驗，嗜肺軍團菌定量結果組間比較采用皮爾遜相關性分析。檢驗水準α=0.05(雙側)。

2 結果和討論

2.1 結果

2.1.1 兩種方法對嗜肺軍團菌檢測的定性結果

兩種方法對84件非飲用水樣本進行檢測。結果顯示，兩種方法均陽性樣本15件，均陰性樣本56件；兩種方法相結合，共有28件樣本分離出嗜肺軍團菌，其中，3件樣本只在過濾培養法中有檢出，10件樣本只在酶底物法中有檢出(表1)。

表1 酶底物法與過濾培養法檢測嗜肺軍團菌的結果Tab.1 Determination Results of Positive Samples Containing Legionella pneumophila by Enzyme Substrate and Filter Culture Methods

酶底物法與過濾培養法對非飲用水樣本中嗜肺軍團菌檢出結果采用McNemar檢驗，兩種方法檢測的差異性無統計學意義(P=0.092)。

2.1.2 兩種方法的特異度與靈敏度

本研究對酶底物法和過濾培養法的陽性樣本均進行了確證，無假陽性。因此，兩種方法特異度均為100%。將檢出的嗜肺軍團菌的全部樣本定義為真陽性樣本(28件)，酶底物法和過濾培養法的靈敏度分別為89.29%(25/28)和64.29%(18/28)。結果顯示，酶底物法靈敏度高于過濾培養法。

2.1.3 過濾培養法中酸處理與熱處理檢測結果

由表2可知，過濾培養法中酸處理和/或熱處理后培養出嗜肺軍團菌的樣本數量為18件，其中，7件只在酸處理后檢出，5件只在熱處理后檢出，6件在兩種方法處理后均有檢出。

2.1.4 兩種方法對不同樣本的檢測結果

本研究共檢測3種樣本(表2)。除了冷凝水，冷卻水與淋浴水中均有檢出嗜肺軍團菌。酶底物法與過濾培養法對冷卻水和淋浴水中嗜肺軍團菌的檢出率經卡方費希爾精確檢驗，差異無統計學意義(P=0.480)。

表2 兩種方法在不同種類樣本中檢出嗜肺軍團菌的樣本數量Tab.2 Positive Samples Containing Legionella pneumophila by Two Methods in Different Kinds of Samples

2.1.5 兩種方法對不同血清型別嗜肺軍團菌的檢出結果

28個樣本中嗜肺軍團菌的血清型別分布為Lp-1型13個，Lp2-14型10個，另有5個樣本Lp-1型與Lp2-14型均有檢出(表3)。這5個樣本中，有4個樣本在過濾培養法中血清型別是單一的。在酶底物法的陽性孔驗證過程發現有混合血清型別菌落存在。

表3 兩種方法檢測嗜肺軍團菌的血清型別分布Tab.3 Serotype Distribution of Legionella pneumophila Detected by Two Methods

兩種方法分離出的嗜肺軍團菌的血清型別分布采用卡方費希爾精確檢驗，差異無統計學意義(P=0.690)。

2.1.6 兩種方法對嗜肺軍團菌檢測的定量結果

28個樣本經過濾培養法和/或酶底物法檢出嗜肺軍團菌，其定量結果計算原理并不相同。過濾培養法根據GVPC上生長菌落數量計算樣本中的CFU含量。酶底物法根據定量盤中變為棕色或出現濁度的大孔和小孔的數目，從Legiolert MPN表獲得所得的MPN值，MPN值則是應用概率理論來估算細菌濃度，但并不能表示實際菌落數。本研究采用皮爾遜相關分析法對28對定量結果進行統計分析(圖1)。結果顯示，兩種方法獲得的嗜肺軍團菌的定量結果具有相關性(皮爾遜相關系數為0.718，P=0.000)。

注：(a)為28個非飲用水樣本中嗜肺軍團菌定量結果散點圖； (b)為(a)圖方框部分放大圖圖1 過濾培養法與酶底物法檢測非飲用水中 嗜肺軍團菌定量結果相關性分析Fig.1 Correlation Analysis of Quantitative Results of Legionella pneumophila in Nonpotable Water by Filter Culture and Enzyme Substrate Methods

2.2 討論

近年來，許多地區將熒光定量PCR、恒溫等溫擴增等定量方法[15-17]引入到對環境樣本中嗜肺軍團菌的監測，但培養方法仍然是金標準。非飲用水中嗜肺軍團菌的含量較少，且存在其他微生物干擾，這是培養方法面臨的兩個挑戰。為了提高培養方法的靈敏性和特異性，GB/T 18204.5—2013[8]在培養前增加了膜過濾、酸處理及熱處理環節，但這些操作大大增加了操作環節和時間。酶底物法也是基于細菌培養進行微生物檢測的方法，目前已廣泛應用于檢測水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌。本研究所采用的酶底物法通過選擇性培養基和預處理環節，保證了該方法檢測水樣中嗜肺軍團菌的靈敏性和特異性。在對檢測結果進行分析時發現，3個樣本酶底物法出現假陰性，過濾培養法計量結果為0.8 CFU/mL，有10個樣本過濾培養法出現假陰性，酶底物法計量結果為1.1～36.1 MPN/mL?？梢?，在樣本中細菌含量較低時，兩種方法均可能出現漏檢，但酶底物法假陰性率低于過濾培養法，呈現較高的靈敏度。該結果與Barrette等[14]的研究結果相同。

不同血清型別的嗜肺軍團菌引發的疾病不同。嗜肺軍團菌Lp-1、Lp-4 和Lp-6 是引起人類肺炎最常見的血清型[18-19]。其中，Lp-1 型是引起社區獲得性肺炎和醫院感染性肺炎的重要病原體[20]。因此，確定嗜肺軍團菌的血清型別可為病因溯源和臨床診斷提供依據。雖然本次研究發現兩種方法分離出的嗜肺軍團菌血清型別差異無統計學意義，但有4個樣本在過濾培養法中培養出來的菌落為1～3個，血清型別是單一的。在酶底物法的陽性孔驗證過程發現多種血清型別?？梢?，在樣本中細菌含量較少時，酶底物法更便于發現混合的血清型別。

3 結論

嗜肺軍團菌是導致軍團病的病原體，本地區集中空調冷卻水及公共場所淋浴水中存在嗜肺軍團菌污染。因此，加強這種病原體的檢測與控制對公眾健康至關重要。本研究表明，酶底物法與過濾培養法對非飲用水中嗜肺軍團菌的檢出結果具有一致性，但酶底物法呈現更高的靈敏度，結合其結果易于判讀、試驗流程簡化等特點，可考慮將酶底物法作為過濾培養法的替代方法。