黃綠蜜環菌硒多糖抗氧化活性及抑菌活性研究

（青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海師范大學生命科學學院，青海西寧 810008）

硒是維持人體和動物正常生長和發育的重要微量元素之一，具有免疫調節、抗癌、抗氧化等多種生物活性[1]。硒的生物學功能取決于其化學形態，作為膳食補充物的有機硒化合物，與無機硒相比，具有吸收利用率高、營養價值高、更健康和安全等優點。大量研究發現，酵母、細菌和真菌等微生物能富集大量硒并將無機硒轉化為有機硒[2-4]。一些學者發現，富硒蕈菌中硒的主要賦存形態為硒蛋白、硒核酸和硒多糖[5-6]。從蕈菌富硒培養物中提取得到的硒多糖，經證實具有一定的抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7-9]。因此，硒多糖可作為很好的補硒劑并應用于藥品或高附加值的食品中。

黃綠蜜環菌（Armillaria luteo-virens）是一種重要的高原特色蕈菌資源，目前還難以實現人工栽培。一些研究者關注黃綠蜜環菌液體培養產生的菌絲體或發酵液中的代謝產物的成分以及生物活性的研究[10-12]，基于硒對液體培養黃綠蜜環菌生長存在一定的作用[13]，探討黃綠蜜環菌富硒培養后產生的胞外多糖的抗氧化活性和抑菌活性，旨在為尋找生產硒源的適當途徑提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黃綠蜜環菌菌株由青海師范大學微生物實驗室提供。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：廣東微生物研究所。

1.1.2 培養基

真菌培養基：PDA培養基配方為去皮馬鈴薯200g、一水葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；液體種子培養基配方為馬鈴薯200 g、一水葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；發酵培養基配方為蔗糖40 g、牛肉膏1 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、蒸餾水 1 000 mL。

細菌培養基：細菌固體培養采用牛肉膏蛋白胨固體培養基，配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL、pH 7.2～7.4（用 1 mol/L NaOH調節pH值）；細菌液體培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4（用1 mol/L NaOH調節pH值）。

1.1.3 試劑與儀器設備

一水葡萄糖（分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；蔗糖（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；蛋白胨（生物試劑）、牛肉膏（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；KH2PO4（分析純）、NaOH（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；MgSO4（分析純）：上海廣諾化學科技有限公司；NaCl（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；蒽酮（分析純）：上海展云化工有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；250B型生化培養箱、V-5100紫外分光光度計：金壇市富華儀器有限公司；CJ-LS型凈化工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5A臺式低速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；SHA-C型水浴恒溫振蕩器：金壇市天競實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 黃綠蜜環菌菌株富硒培養

將3塊4 mm直徑的黃綠蜜環菌菌塊接種于種子培養基中，250 mL三角瓶中裝入100 mL培養液，于25℃培養4 d，所獲培養液作為液體菌種。以15%的接種量將液體菌種接種至發酵培養基中，于25℃下培養4 d時加入100 μL的800 mmol/L亞硒酸鈉，使發酵培養基硒濃度為0.80 mmol/L，置于25℃條件下繼續培養至8 d。

1.2.2 黃綠蜜環菌硒多糖的提取與純化

發酵產物以4 000 r/min離心10 min，得到菌絲體和發酵液。發酵液經旋轉蒸發儀于50℃減壓濃縮至原體積的20%左右，加3倍體積95%乙醇，放入4℃冰箱中醇析24 h，得絮狀沉淀，95%乙醇洗滌兩次，Sevag法（氯仿∶正丁醇4∶1，體積比）脫蛋白后，45℃條件下干燥得胞外硒多糖。

1.2.3 黃綠蜜環菌硒多糖中硒含量和多糖的測定

根據GB5009.93-2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》[14]（第一法），依托廣東東方縱橫檢測有限公司對硒多糖中硒含量進行檢測；采用蒽酮-硫酸法[15]測定多糖的含量。

1.2.4 清除羥基自由基

吸取2 mL濃度為9 mmol/L FeSO4溶液與2 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、2 mL不同濃度的樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）及 2 mL的8.8 mmol/L H2O2混合，置于37℃水浴30 min，冷卻至25℃室溫后在510 nm波長處測定吸光度（用蒸餾水調零）[16]，不同濃度的抗壞血酸溶液作為對照。羥基自由基清除率計算公式為：羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A1為樣品反應后的吸光度；A2為樣品溶液和蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.2.5 清除DPPH自由基

吸取2.5 mL DPPH乙醇溶液（40.00 mg/L）與0.5 mL 不同濃度的樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混勻，于37℃的恒溫水浴下避光反應30 min，在517 nm波長處測定混合液的吸光度（用無水乙醇調零），以抗壞血酸作為對照[17]。DPPH自由基清除率計算公式為：DPPH自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為2.5 mL DPPH和0.5 mL無水乙醇溶液的吸光度；A1為2.5 mL DPPH和0.5 mL樣品溶液的吸光度；A2為2.5 mL無水乙醇和0.5 mL樣品溶液的吸光度。

1.2.6 清除ABTS+自由基

取0.2 mL 7.40 mmol/L ABTS溶液與0.2 mL 2.60 mmol/L過硫酸鉀溶液混勻，在黑暗、25℃室溫條件下放置12h后，用無水乙醇稀釋40倍～50倍，以734nm波長處測得的吸光度（0.7±0.02）為宜。再取4 mL上述混合液與 1 mL不同濃度樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混合，振搖 10 s，靜置 6 min，在734 nm波長處測定混合液的吸光度[18]。ABTS+自由基清除率計算公式為：ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為4 mL混合液和1 mL無水乙醇的吸光度；A1為4 mL混合液和1 mL樣品溶液的吸光度；A2為4 mL無水乙醇和1 mL樣品溶液的吸光度。

1.2.7 硒多糖對細菌的抑菌效果

分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37℃培養18 h～24 h，采用血球計數板法檢測細菌濃度，制備106cfu/mL細菌懸浮液。

采用濾紙片擴散法（濾紙片直徑6 mm）測定濃度為 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL 硒多糖或亞硒酸鈉對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用。在無菌培養皿中倒入適量牛肉膏蛋白胨固體培養基，待其冷卻，加入0.10 mL供試菌液，涂布均勻，制成含菌平板，將無菌的濾紙片放入平板中央，吸取不同濃度的硒多糖或亞硒酸鈉溶液10 μL滴在滅菌的濾紙片上，將處理好的平板置于37℃培養24 h后觀察濾紙片周圍抑菌圈的大小，并測量其直徑。0.04%和0.06%鏈霉素作為陽性對照，陰性對照為無菌水，每個處理重復3次。

1.3 統計分析

試驗數據結果均采用平均值±標準差表示，各項測定指標通過SPSS16.0軟件進行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 黃綠蜜環菌硒多糖中硒和多糖的含量

黃綠蜜環菌硒多糖中硒含量為（2.84±0.23）g/kg，多糖含量為（56.27±0.35）%。

2.2 黃綠蜜環菌硒多糖的抗氧化活性

2.2.1 黃綠蜜環菌硒多糖對羥基自由基的清除能力

不同濃度的黃綠蜜環菌硒多糖或抗壞血酸對羥基自由基的清除效果見圖1。

濃度為2.50 mg/mL～12.50 mg/mL的抗壞血酸對羥基自由基的清除能力相對較高，達到96.43%～98.84%；黃綠蜜環菌硒多糖對羥基自由基清除能力隨著濃度的升高清除率顯著地增加（P＜0.05），但在相同濃度下硒多糖的清除率均低于抗壞血酸。

2.2.2 黃綠蜜環菌硒多糖對DPPH自由基的清除能力

圖 2 表示濃度為 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL黃綠蜜環菌硒多糖或抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力。

圖2 黃綠蜜環菌硒多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical activity of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

抗壞血酸在測試濃度下對DPPH清除率達到96%～97%；而硒多糖清除DPPH自由基的能力隨著濃度的升高而顯著上升（P＜0.05），其清除DPPH自由基的效果低于抗壞血酸。

2.2.3 黃綠蜜環菌硒多糖對ABTS+自由基的清除能力

不同濃度的黃綠蜜環菌硒多糖和抗壞血酸對ABTS+自由基有較高的清除效果見圖3。

圖3 黃綠蜜環菌硒多糖對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical activity at different of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

濃度為2.50 mg/mL～12.50 mg/mL抗壞血酸清除效果較穩定，而硒多糖清除ABTS+自由基的能力隨濃度的增加呈現顯著地上升趨勢（P＜0.05），但硒多糖的清除效果不如抗壞血酸。

2.3 黃綠蜜環菌硒多糖對細菌的抑菌效果

黃綠蜜環菌硒多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑見表1。

表1 黃綠蜜環菌硒多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 1 The inhibition zones of selenium-containing polysaccharide extracted from A.luteo-virens against S.aureus and E.coli

由表1結果可知，相同濃度下黃綠蜜環菌硒多糖抑菌效果低于亞硒酸鈉。所測試濃度的黃綠蜜環菌硒多糖對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌效果較明顯；且濃度為7.50 mg/mL～10.00 mg/mL硒多糖對大腸桿菌的抑菌效果顯著高于2.50 mg/mL～5.00 mg/mL的硒多糖（P＜0.05）。不同濃度的亞硒酸鈉對大腸桿菌抑菌效果也存在顯著性差異（P＜0.05），但濃度達到10.00 mg/mL～12.50 mg/mL的亞硒酸鈉才能抑制金黃色葡萄球菌的生長。

3 討論與結論

許多蕈菌作為硒的載體，使硒與多糖組分結合形成硒多糖[4-7]，靈芝在亞硒酸鈉濃度為 100、200、250 μg/kg的基質上生長，獲得3種硒多糖中多糖含量依次為85.9%、86.3%、87.1%，而硒含量分別為 20.53、49.62、60.50 μg/g[7]。本研究中利用黃綠蜜環菌在0.8 mmol/L亞硒酸鈉濃度下培養獲得的胞外硒多糖中硒的含量為（2.84±0.23）g/kg，多糖含量為（56.27±0.35）%，由此說明富硒培養時菌種不同、加入無機硒的濃度不同，提取出的硒多糖的硒含量也會存在差異，而多糖含量相對恒定。

通過體外抗氧化活性測定，從富硒蕈菌中獲得的硒多糖對羥基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力高于不加硒得到的多糖，說明了硒在抗氧化能力方面起到關鍵性作用[7-8]，隨著硒多糖濃度的增加其抗氧化活性增強，但清除自由基的能力仍不如抗壞血酸[8]。本研究結果也證實黃綠蜜環菌硒多糖抗氧化活性與其濃度密切相關。

蕈菌液體培養產生的多糖物質除了具有抗氧化活性外，還對細菌、真菌等微生物具有抑制作用[19-20]。以豬苓多糖和亞硒酸鈉為原料，采用化學合成法制備豬苓硒多糖，豬苓硒多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑制效果強于豬苓多糖[21]?？梢?，硒能提高多糖的抑菌能力。本試驗發現黃綠蜜環菌硒多糖對大腸桿菌的抑菌效果明顯，而對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果（表1）。黃綠蜜環菌富硒培養后獲得的胞外硒多糖，體外測試具有一定的清除自由基能力和抑制細菌生長的活性，而有關黃綠蜜環菌硒多糖動物試驗功能特性的表現以及應用于食品中發揮的功能作用還有待進一步的研究。