布魯氏菌IV型分泌系統效應蛋白BPE043的功能和致病機制研究

羅文博，付夢姣，焦 俊，馮俊霞，盧志宇，胡雪媛，溫博海，趙曉冬，熊小路，周冬生，柯躍華

布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)侵入機體造成的一種人獸共患病，以流產和發熱為特征，對人和動物的生命健康造成了嚴重威脅[1]。布魯氏菌為兼性的革蘭氏陰性菌[2-4]，毒力主要表現為胞內寄生[5]。布魯氏菌可以通過形成布魯氏菌泡(BCV)來避免被溶酶體降解，從而在胞內生存和復制[6]，不會造成細胞的程序性死亡[7]。

布魯氏菌IV型分泌系統(Type IV secretion syster ms，T4SS)是貫穿細胞壁和外膜的，由12個基因編碼的蛋白組成的復合物[8]，是布魯氏菌致病的主要毒力因子。T4SS主要通過分泌蛋白來干擾宿主細胞的正常功能。其分泌的效應蛋白近些年被不斷發現，目前被報道的共有15種[9]，大多數效應蛋白的功能和作用機制未知，BPE043是其中之一。本文研究的BPE043保守區域為環狀核苷酸結合結構域[10]。其他功能有待研究。

Rab是小G蛋白超家族中最大的旁支，通常被認為是信號調控的分子開關，在調節囊泡的形成、?？亢娃D移方面起調節作用[11]。Rab蛋白在布魯氏菌感染細胞后形成的BCV中被發現[12]。本研究以布魯氏菌野生株104為起始菌株，構建了BPE 043基因的缺失株，通過進行生長曲線測定、小鼠感染能力測定以及篩選有可能與BPE043有相互作用的宿主蛋白等，初步研究了BPE043蛋白的功能，為進一步研究BPE043在布魯氏菌感染過程中的作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌104株由中國人民解放軍疾病預防控制中心保存，布魯氏菌BPE 043基因突變株由實驗室構建。

1.1.2 試劑 布魯氏菌培養基Bucella Broth和Bucella Broth Agar購自BD公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自AOBOX公司;PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase、Clon ExpressTMMulti S重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;基因組提取試劑盒購自QIAGEN公司;感受態細胞DH5α購自天根生化科技有限公司(北京);抗體購自Cell Signaling Technology(CST)公司;轉染試劑盒Lipofecta mine 3000 Transf ection Kit購自invitrogen;免疫共沉淀試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.1.3 實驗動物 選取30只SPF級的BALB/c小鼠，均為雌性，6周齡。購于北京維通利華公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物合成 本實驗所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 布魯氏菌BPE 043基因突變株載體構建所需引物Tab.1 Primers for constr uction of BPE 043 gene mutant vector of Brucella

1.2.2 布魯氏菌BPE 043基因突變株載體的構建根據BPE 043基因兩端的序列設計N端和C端的同源臂引物。然后以羊種布魯氏菌野生株104的序列為模板，以BPE 043-N-F、BPE 043-N-R引物和BPE 043-C-F、BPE 043-C-R引物分別擴增BPE 043基因N端和C端的同源臂。以卡那霉素表達質粒p UC19質粒為模板，用引物KANA-F和KANA-R擴增卡納抗性基因。將獲得的BPE 043左右同源臂和卡那片段進行純化，利用同源重組試劑盒將純化片段連入載體p MD-18 T。將載體導入感受態細胞DH5α。在卡那平板上進行篩選后，提質粒測序鑒定。質粒命名為p MD-18T-BPE 043-K。

1.2.3 布魯氏菌BPE 043基因突變株的構建 將質粒p MD-18 T-BPE 043-K電轉化到羊種布魯氏菌野生株104的感受態細胞中。接種進行活化后，涂布于卡那抗性的布魯氏菌TSA固體平板上進行篩選，將疑似陽性克隆用卡那替換目的基因的內引物和外引物進行PCR鑒定。將陽性克隆命名為104ΔBPE 043。

1.2.4 突變株與野生株生長曲線的測定 將活化后的羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043各取2μL分別接種于10 mL布魯氏菌液體培養基中。在37℃、200 r/min條件下培養至OD600為0.6。將菌液稀釋到OD600為0.2。在37℃、200 r/min條件下繼續培養。每1 h取樣一次測OD值，每個樣品做3次重復取均值。直到進入平臺期。繪制104和104ΔBPE 043的生長曲線。

1.2.5 小鼠感染試驗 將30只雌性、6周齡的BALB/c小鼠隨機分為2組，分別接種羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043(腹腔注射)。接種劑量為1×106cf u/只。2組小鼠分別在接種后的1至5周每周處死3只，測量脾臟重量。剪取0.05 g脾臟于EP管中加800μL的PBS進行研磨，進行合適倍數的稀釋后進行涂板。37℃恒溫箱中培養48 h后進行菌落計數。

1.2.6 免疫共沉淀尋找布魯氏菌效應蛋白BPE043的互作蛋白 將鼠源Rab3、Rab 4、Rab 8、Rab 11、13、Rab 14、Rab 35基因克隆至含有Flag標簽的真核表達載體上，構建 Flag-Rab 3、Flag-Rab4、Flag-Rab 8、Flag-Rab 11、Flag-Rab 13、Flag-Rab 14、Flag-Rab 35重載質粒。再將BPE 043基因克隆至含有Myc標簽的真核表達載體上，構建Myc-BPE 043重載質粒。所有重組質粒均由北京擎科生物科技有限公司合成。用Lipof-ecta mine 3000 Transfection Kit試劑盒在HeLa細胞中分別共轉染Myc-BPE 043 和 Flag-Rab 3、Flag-Rab 4、Flag-Rab 8、Flag-Rab 11、Flag-Rab 13、Flag-Rab 14、Flag-Rab 35等質粒，轉染質粒濃度為1 000 ng/mL。轉染后24 h去掉培養基，細胞用PBS洗滌，再用胰蛋白酶處理，3 000 r/min離心5 min收集細胞。去掉上清，加細胞裂解液和SDS×Loading Buffer。離心后得到上清液。留取少量上清液，其他用免疫共沉淀試劑盒處理(加入抗Myc抗體)，得到免疫沉淀物。通過Wester n Blotting來檢測上清液和免疫沉淀物中的Myc和Flag標記。

2 結 果

2.1 p MD-18T-BPE 043-K自殺載體的構建與鑒定以羊種布魯氏菌野生株104為模板，分別用以引物 BPE 043-N-F、BPE 043-N-R 和 BPE 043-C-F、BPE 043-C-R擴增BPE 043基因兩端的同源臂;以質粒p UC19為模板，用引物KANA-F和KANA-R擴增卡那抗性基因片段。BPE 043基因兩端同源臂以及卡那抗性基因片段的大小均與預期一致。用同源重組試劑盒將同源臂和卡納基因純化片段連接載體質粒p MD-18T，獲得重組質粒p MD-18TBPE 043-K。以重組質粒為模板，BPE 043-N-F、BPE 043-C-R為引物進行PCR擴增，獲得大小為600 bp左右的片段，與預期一致。

2.2 布魯氏菌BPE 043基因突變株的構建與鑒定將重組質粒p MD-18 T-BPE 043-K轉入DH5α中，擴大培養，用卡那平板篩選后，以BPE 043-N-F、BPE 043-C-R為引物進行PCR擴增，獲得片段大小為600 bp左右，與預期一致。提取質粒后，電轉到羊種布魯氏菌野生株104中。發生同源重組后，用卡那平板篩選疑似陽性克隆，用內引物N-I-F、N-IR和C-I-F、C-I-R分別擴增野生株104以及疑似同源重組陽性菌株。野生株擴增結果為陰性，疑似陽性克隆N端和C端擴增分別獲得大小為163 bp和128 bp的片段，與預期一致(圖1)。104ΔBPE 043構建成功。

2.3 突變株與野生株的生長曲線分析 將OD600稀釋為0.2的羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043繼續在37℃、200 r/min條件下培養，每隔1 h取樣測OD值，連續取樣20 h，繪制生長曲線如圖2?？梢娫? h到12 h之間突變株濃度略低于野生株，其他時間段兩菌濃度基本一致。突變株與野生株總體生長趨勢大致相同。表明BPE 043基因的缺失并不會對布魯氏菌的生長情況造成顯著的影響。

2.4 小鼠體內感染試驗 用羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043分別對2組小鼠進行腹腔注射1×106cf u/只劑量后，1周后可以在脾臟中檢測到布魯氏菌。比較第1到5周2組小鼠脾臟重量和脾細菌載量。結果顯示，第1周2組小鼠脾均腫大，但突變株104ΔBPE 043感染組小鼠體重低于野生株104感染組。第2周2組小鼠脾重均達到最大。之后2組小鼠脾重均開始下降，突變株104ΔBPE 043感染組下降速度較快。2組差值逐漸增大(圖3 A);在脾細菌載量方面，第1周2組小鼠脾細菌載量均達到最高值，且突變株104ΔBPE 043感染組低于野生株104感染組。第2周2組小鼠脾細菌載量均下降，二者差值依然較大。之后3到5周野生株104感染組脾細菌載量基本維持不變，而突變株104ΔBPE 043感染組脾細菌載量快速下降(圖3B)。結果表明BPE043的缺失降低了布魯氏菌在小鼠體內的毒力，也降低了其在體內的復制能力。

圖1 PCR驗證B.melitensisΔBPE 043突變株結果Fig.1 Test of B.melitensisΔBPE 043 mutant strain by PCR

圖2 104,104ΔBPE 043生長曲線的測定Fig.2 Growth of the 104,104ΔBPE 043

圖3 布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043小鼠體內感染試驗中脾臟重量(A)和脾細菌載量(B)分析Fig.3 Analysis of the weight(A)and the bacterial load(B)bet wween WT 104 and 104ΔBPE 043 in the spleen

2.5 免疫共沉淀篩選布魯氏菌效應蛋白BPE043的互作蛋白 HeLa細胞轉染24 h后收取樣品，獲得上清液;留存少量上清液后，其他部分用免疫共沉淀試劑盒(加入抗Myc抗體)處理得到免疫沉淀物。用Wester n Blotting分別檢測各樣品的上清液和免疫沉淀物中的Myc和Flag標記。結果如圖4。各樣品上清液中Myc和Flag檢測均為陽性，說明各質粒已成功轉入細胞，可排除后續結果中的假陽性;以藕聯Myc抗體的填料對樣品進行免疫共沉淀，SDS-PAGE檢測免疫共沉淀。結果顯示所有樣品Myc檢測全部為陽性，說明Myc-BPE043蛋白被成功沉淀下來。Flag檢測顯示只有 Myc-BPE043、Flag-Rab4和 Myc-BPE043、Flag-Rab11轉染組為陽性，說明BPE043和Rab4、Rab11存在相互作用。

圖4 免疫共沉淀篩選BPE043互作蛋白Fig.4 Screening protein interactions of BPE043 by co-immunoprecipitation

3 討 論

布魯氏菌IV型分泌系統(Type IV secretion syster ms，T4SS)由vir B操縱子調控，參與布魯氏菌感染宿主后的胞內活動。T4SS組裝完成后，布魯氏菌即可通過T4SS分泌效應蛋白來感染宿主細胞[13]。目前已經發現了15個由T4SS分泌的效應蛋白[9]。其中VirB調控的效應物A(Vce A)和效應物C(VceC)是最早發現的2個效應蛋白[14]。BPE043和BPE123、BPE005等是另一部分T4SS分泌的蛋白，具有高度保守性[15]。但對其功能和作用機制尚不清楚。因此，本研究對BPE 043基因在布魯氏菌感染和胞內生存過程中的功能做了初步探索。

研究基因的功能常用到基因敲除的方法。其中同源重組因其可以精準替換目的基因且遺傳穩定，是基因敲除中最常用方法。本研究中以羊種布魯氏菌104為模板，通過同源重組構建了布魯氏菌BPE 043基因缺失株，進行了生長曲線和小鼠體內感染的測度，篩選了宿主細胞內的靶蛋白，初步說明了BPE 043基因在布魯氏菌感染和胞內生存過程中起重要作用。

生長曲線測定試驗顯示，在0到20 h測定時間內，羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043的生長趨勢大致相同。只有在8～12.5 h之間，突變株的細菌濃度略低于野生株。兩者差值很小。這有可能與試驗偶然性有關?；究梢哉J為BPE 043基因的缺失不會影響布魯氏菌的生長趨勢。

小鼠體內感染試驗顯示，羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE043感染小鼠后均會在1周后檢測到小鼠脾臟重量的升高，說明它們均有致病性，會引起小鼠脾臟的腫大。但野生株感染組小鼠脾臟重量的上升高于突變株感染組，且2周后突變株感染組小鼠脾臟重量持續下降;同樣，突變株感染組小鼠脾細菌載量2周后快速下降，而野生株感染組在感染2周以后下降速度變緩，且野生株感染組脾細菌載量全程高于突變株感染組。說明BPE043在布魯氏菌對小鼠進行體內持續感染的過程中起重要作用。該基因的缺失對布魯氏菌的毒力影響非常顯著。

免疫共沉淀試驗顯示，在將帶有Myc標簽的BPE043和帶有Flag標簽的相關Rab蛋白成功轉入細胞后，使用Myc抗體對Myc-BPE043蛋白進行吸附，檢測結果全部為陽性。在對Flag的檢測中，只有Rab4和Rab11為陽性。說明二者與BPE043存在相互作用。Rab相關蛋白在布魯氏菌感染宿主形成的BCV中被發現[12]，本試驗說明BPE043和Rab4、BPE043和Rab11 2對互作蛋白很可能在BCV的形成以及逃避宿主的免疫機制方面起一定的作用。值得注意的是，試驗中Rab8和Rab13的陽性結果不是很明顯，其是否與BPE043存在相互作用有待于進一步研究。

綜上所述，本研究表明BPE 043基因不會影響布魯氏菌體外的生長特性，但對于布魯氏菌對宿主的感染和胞內生存有重要作用。并確定了與BPE043存在相互作用的蛋白Rab4和Rab11。為進一步研究BPE043在布魯氏菌中的功能和致病機制奠定了基礎。