無菌馬尾松種子超低溫保存技術研究

張曉寧 黃寧 覃子海 姚瑞玲 楊紅 劉海龍

摘?要：該研究利用液氮將不同含水量的無菌馬尾松種子（27.4%、24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%）進行超低溫保存。結果表明：（1）在3.2%～6.1%含水量范圍內，經液氮冷凍保存后的發芽率隨著含水量升高而逐漸升高，在含水量6.1%時，發芽率達到最大值（91.33%）;當含水量大于6.1%時，發芽率逐漸下降，尤其是當含水量大于15.8%時，發芽率迅速下降;在3.2%～7.5%含水量范圍內凍存后發芽率在80%以上。（2）冷凍、化凍方式影響超低溫保存效果。種子無需低溫預冷，直接投入液氮保存（快速冷凍）效果最好;室溫空氣化凍（緩慢化凍）較42?℃水浴化凍發芽率高，且后者容易發生種皮炸裂現象。（3）種皮對馬尾松種子超低溫保存過程起到保護作用，使其免受機械損傷，去掉外種皮的種子凍存后發芽率顯著下降，且容易出現形態不正常的幼苗。（4）超低溫保存對馬尾松種子萌發具有一定“刺激”作用，在最適含水量6.1%時，經超低溫保存后種子的發芽率顯著大于對照種子?？傊?，含水量、冷凍方法、化凍方法、種皮結構顯著影響超低溫保存效果，馬尾松種子超低溫保存的最優方法是將種子含水量控制在6.1%，直接投入液氮快速冷凍后室溫空氣緩慢化凍，凍后發芽率可在90%以上。馬尾松種子超低溫保存技術體系的建立，為其種質資源的長期保存提供了技術支持。

關鍵詞：馬尾松種子，超低溫保存，干燥，含水量，安全含水量范圍，發芽率

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）07-0935-09

Abstract：To?explore?long?term?preservation?of?Pinus?massoniana?seeds?through?cryopreservation?technology，aseptic?seeds?of?P.?massoniana?with?different?water?contents?（WC）?（27.4%，24.6%，22.7%，16.8%，15.8%，10.7%，7.5%，6.1%，4.8%，3.2%）?were?cryopreserved?in?liquid?nitrogen.?Our?results?showed?that：（1）?The?germination?of?cryopreserved?seeds?increased?when?the?seed?WC?elevated?from?3.2%?to?6.1%，reaching?the?highest?rate?of?91.33%?at?the?optimum?WC?of?6.1%;?However，seed?germination?decreased?as?WC?further?increased?from?6.1%?to?27.4%，in?particular，?with?a?rapid?decline?in?germination?of?seeds?with?15.8%?or?higher?WC;?There?is?a?wide?range?of?safe?WC，within?3.2%-7.5%，the?average?germination?rate?reached?above?80%.?（2）?In?addition?to?WC，freezing?and?thawing?methods?also?affected?cryopreservation.?Rapid?freezing?by?directly?immersing?seeds?into?liquid?nitrogen?is?better?than?pre-freezing?at?-20?℃?prior?to?liquid?nitrogen?freezing;?a?slow?air-thawing?at?room?temperature?gave?a?better?germination?result?compared?with?a?rapid?thawing?in?a?42?℃?water?bath?that?caused?seed?episperm?cracking.?（3）?The?episperm?also?played?an?important?role，which?protected?the?seeds?from?the?mechanical?damage.?The?germination?rates?without?episperm?were?significantly?lower?than?those?with?episperm，and?the?abnormal?seedlings?were?more?observed?when?the?episperms?were?removing.?（4）?At?the?optimum?WC?of?6.1%，cryopreserved?seeds?germinated?better?than?those?non-cryopreserved?（control），indicating?that?cryopreservation?may?stimulate?seed?germination?of?P.?massoniana.?Collectively，our?results?showed?that?water?content，freezing?and?thawing?methods?as?well?as?the?episperm?structure?can?significantly?affect?cryopreservation?of?P.?massoniana?seeds;?and?the?best?method?for?cryopreservation?of?P.?massoniana?seeds?is?to?directly?freeze?seeds?with?6.1%?WC?using?liquid?nitrogen?followed?by?a?slow?air-thawing?at?room?temperature，by?which?the?germination?can?reach?above?90%.?Results?from?this?study?may?provide?a?rational?for?a?long-term?storage?of?P.?massoniana?seeds?through?cryopreservation.

Key?words：Pinus?massoniana?seeds，cryopreservation，desiccation，water?content，range?of?safe?water?content，germination?percentage

馬尾松（Pinus?massoniana）為松科松屬常綠高大喬木，是我國分布最廣的優質鄉土針葉及南方主要造林、綠化樹種，廣泛應用于用材、產脂、荒山造林及制漿造紙，在森林資源建設及生態發展中發揮著極其重要的作用（秦國峰和周志春，2012;楊章旗，2012）。廣泛的地理分布和悠久的進化起源賦予馬尾松種質資源豐富的遺傳多樣性，由于自然環境惡化及人為破壞等因素，所以其天然林在演替過程中逐漸被常綠闊葉林和人工林替代，加上單一人工林在應對病蟲害及惡劣環境等自然災害方面存在的局限性，其種質資源多樣性正受到嚴重威脅（石娟等，2005;鄧倫秀和李茂，2009）。因此，開展對馬尾松種質資源保存的研究就顯得尤為迫切和必要。種子作為植物生命的載體，蘊含著豐富的遺傳信息，是遺傳改良、品種創新和良種生產的重要物質基礎。種子的離體保存能在有限的空間最大限度地保存材料的遺傳多樣性，且不受病蟲害及天氣等影響，具有成本低、效率高、交流、運輸方便等優點，是目前馬尾松種質資源保存最主要的方式之一。

秦國峰等（2017a）研究表明馬尾松種子隨著保存期限的延長，其品質不斷下降，常溫開放保存3～4?a幾乎全部喪失發芽力，在2～4?℃低溫密閉保存可在10?a以上。雖然低溫密閉條件延長了馬尾松種子的保存期限，但相比其漫長的生命周期和從發芽到產生可用于繁殖下一代種子的時間間隔仍顯短暫，從保障種質資源安全的角度來看，延長其保存期限具有重要意義，而超低溫保存正是目前為止實現種質資源長期保存的最佳途徑。

種子的超低溫保存是指將種子投入到液態氮（-196?℃）或氣態氮（-150?℃）條件下進行保存。在此溫度下，大多數植物的種子新陳代謝活動基本停止，劣變最大限度降低，理論上可以保存成百上千年（Walters?et?al.，2004;Basu，2008），是目前一種集簡便、實用、占地少、低成本于一體的長期保存種質資源的方法（Wilde，2015）。超低溫保存技術已成功應用于多種木本植物成熟種子或種胚的保存，如櫻桃（宋常美等，2019）、樟樹（馬健等，2019）、黑楊（Marcin?et?al.，2015）、合歡和青杄（河英虎等，2013）、高山栲（盧玲等，2013）、紅豆杉（程利紅等，2012）。

孫鴻有等（1994）的研究認為，馬尾松種子最適保存溫度是-18～-15?℃。

喻方圓等（2006a）研究認為，種子在-30?℃儲藏初期發芽率就開始大幅下降。譚?。?009）研究認為，從種子的安全貯藏來看，馬尾松種子不適合在-25?℃及以下的溫度貯藏。喻方圓等（2006b）利用差式掃描量熱儀證明，馬尾松種子在-24.826?℃的溫度下結晶，細胞質中粗脂肪含量高，低聚糖與蔗糖比值低，決定了其難形成玻璃化狀態，并推測這是馬尾松種子不耐-30?℃以下儲藏的主要原因。

楊學軍（2008）首次利用脫水干燥法將馬尾松種子進行了超低溫保存，當含水量為4.3%時，獲得80%的發芽率，但主要針對含水量和冷凍保護劑對超低溫保存效果的影響進行了研究。本研究在此基礎上，以無菌種子為材料，系統研究了含水量、冷凍方式、化凍方式及種皮的保護作用等對凍存效果的影響，簡化了馬尾松種子超低溫保存技術體系，提高了保存效率，確定了最適含水量和安全含水范圍，并首次指出超低溫保存對馬尾松種子具有一定“刺激”作用，進一步驗證馬尾松種子超低溫保存的可行性。這對馬尾松種子資源長期保存提供了理論指導和技術支撐，為其他林木種子的超低溫保存研究提供參考。本研究利用無菌種子不僅消除了種子發霉對發芽率的干擾和影響，而且還可直接獲得無菌幼苗用于后續研究。

1?材料與方法

1.1?種子質量特性的測定及含水梯度的建立

試驗用馬尾松種子于2017年11月采自廣西藤縣。試驗用干燥箱：上海施都凱，BAO-150A;超凈工作臺：蘇州凈化SW-CJ-2D;光照培養箱：杭州匯爾GZH-0158;冷凍管：美國?Nunc;硅膠：上海新火;KMnO4?：鄭州中天實驗儀器有限公司;升汞：貴州省銅仁化工研究所。

參照《林木種子檢驗規程》（國家質量技術監督局，2000）要求測定千粒重、初始含水量和發芽率等種子質量特性。

1.1.1?發芽率的測定?將待測種子播種于含雙層濾紙的培養皿，定期噴水，保持濾紙濕潤。光照培養箱27?℃黑暗培養5?d;?第6天開始，光照強度2?000?lx，光照時間8?h·d-1。當根長等于種子長時記為發芽。發芽率=（發芽種子數/種子總數）×100%。4個重復，每重復100粒。

1.1.2?初始含水量（ω0）的測定?采用低溫烘干法（103?℃烘干16?h）測定，ω0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。3個重復，每重復50?g。

1.1.3?含水梯度的獲取?消毒后的種子采用浸種和硅膠干燥的方式獲取27.43%～3.2%的10個含水量梯度的種子，密閉于雙層鋁箔袋中4?℃保存備用。實際含水量（ω1）采用減重法計算，ω1=100%-[最初重量×（100%-相對含水量）]/最后重量。（消毒方式：流水沖洗2?h，0.5%?KMNO4浸泡0.5?h，無菌水沖洗6次，0.1%升汞消毒5?min，無菌水沖洗6次。）

1.2?種子的超低溫保存試驗

1.2.1?不同含水量對凍存后發芽率的影響?先取含水量分別為3.2%、4.8%、6.1%、7.5%、10.7%、15.8%、16.8%、22.7%、24.6%、27.4%的馬尾松種子裝于1.8?mL冷凍管中直接投入液氮保存24?h后，室溫自然化凍，隨后將種子播于鋪有三層無菌濾紙的培養皿中，封口，置于光照培養箱進行發芽試驗，并測定凍存后發芽率。

1.2.2?冷凍方式對凍存后發芽率的影響?取含水量為3.2%、4.8%、6.1%、10.7%、16.8%、22.7%、27.4%的?7個梯度的種子裝于冷凍管中進行如下操作：（1）快凍法：直接投入液氮;（2）緩凍法：經-20?℃預凍30?min投入液氮;（3）慢凍法：經-20?℃低溫預處理24?h后投入液氮。三種冷凍方式統一在液氮保存24?h后，室溫自然化凍，統計發芽率。

1.2.3?化凍方式對凍存后發芽率的影響?先將上述7個含水量梯度的種子直接投入液氮，凍存后的材料從液氮中取出，設置室溫空氣化凍、42?℃水浴化凍兩種化凍方式各5?min后，再將種子播于鋪有三層無菌濾紙的培養皿，封口，置于光照培養箱黑暗培養，記錄凍存后發芽率。

1.2.4種皮對凍存后發芽率的影響?取含水量為27.4%、10.7%、6.1%?和3.2%的種子，剝去種皮，裝于1.8?mL冷凍管，直接投入液氮保存24?h，室溫空氣化凍后，測定發芽率。

1.2.5超低溫保存對種子發芽率的影響?取含水量為27.4%、10.7%、6.1%和3.2%的種子裝于1.8?mL冷凍管中直接投入液氮保存24?h，室溫空氣化凍后置于含三層濕潤濾紙的培養皿測定凍存后發芽率;對照不經液氮直接放入相同條件培養皿測定發芽率。

1.3?數據分析

試驗設置3個重復，每個重復100粒種子。采用Microsoft?Office?Excel（2016）軟件對數據進行統計分析和繪圖。試驗結果為3個重復的平均值±標準誤。數據差異的顯著性采用SPSS方差分析中的?Duncan?新復極差法進行估算。

2?結果與分析

2.1?種子的質量特性及含水量梯度的建立

待測馬尾松種子千粒重為11.48?g，含水量為9.56%，發芽率為90.25%。利用浸種和硅膠干燥的方式獲取含水量為27.4%、?24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%等10個梯度的種子，用以進行超低溫保存等后續研究。

2.2?不同含水量對超低溫保存后種子發芽率的影響

10個不同含水量梯度的馬尾松種子凍存后發芽率結果如圖1所示。隨著含水量的下降，凍存后發芽率逐漸增高，直到含水量降為6.1%時，發芽率達到最大值91.33%，當繼續干燥，發芽率不再上升，甚至有輕微的下降，6.1%為馬尾松種子超低溫保存的最適含水量。含水量為6.1%～15.8%時，發芽率緩慢下降;當含水量大于15.8%時，發芽率急劇下降。含水量從15.8%增加到16.8%時，發芽率從69.33%迅速下降到45.67%。馬尾松種子適宜超低溫保存的含水量范圍很廣，將凍后發芽率在80%以上的含水量范圍3.2%～7.5%作為馬尾松種子超低溫保存的安全含水量范圍。

2.3?不同冷凍方式對超低溫保存后種子發芽率的影響

不同冷凍方式對超低溫保存效果的影響如圖2所示。不同含水量的種子利用緩凍和慢凍法進行超低溫保存后發芽率均不同程度地低于快凍法保存，結果表明將馬尾松種子直接投入液氮保存效果優于先在-20?℃預凍不同時間再投入液氮。

2.4?不同化凍方式對馬尾松種子超低溫保存后發芽率的影響

室溫空氣化凍和42?℃水浴化凍對馬尾松種子超低溫保存效果的影響如圖3所示。圖3結果顯示，室溫空氣化凍效果優于?42?℃水浴化凍，含水量越小，兩種化凍方式的差異越明顯，采用室溫空氣化凍后不需要回濕直接置于含濕潤濾紙的培養皿進行發芽試驗。另外，研究發現42?℃水浴化凍會發生種子炸裂現象，致使種子受到機械損傷。

2.5?外種皮對超低溫保存效果的影響

外種皮對超低溫保存效果的影響如圖4所示，在4個含水量梯度下，帶外種皮的種子保存后發芽率顯著高于去掉外種皮的種子，但去掉外種皮種子凍存后露白時間要早于帶外種皮的種子1～2?d，可能是解除了種皮的機械限制作用的結果。

保留外種皮的種子胚根先突破胚乳和種皮長出，接著下胚軸延伸，當下胚軸伸長到一定程度后，子葉初現如圖5：A，B所示，去掉外種皮的種子發芽情況如圖5：C-G所示。其中：圖5：C，D所示為正常發育的種子，胚根先突破胚乳長出（圖5：C），后下胚軸延長、子葉初現（圖5：D）;圖5：E-G為發育順序或幼苗形態異常的情況，子葉和下胚軸同時在種子兩端生長（圖5：E），子葉和下胚軸在胚根發育相反一側先于胚根發育（圖5：F），子葉和下胚軸在種子中間突破胚乳發育延長（圖5：G）。這種發育順序異?；蛘哒f幼苗形態異?，F象的具體原因及機理機制有待于深入研究。

2.6?超低溫保存對種子發芽率的影響

含水量為3.2%、6.1%、10.7%、27.4%的馬尾松種子經超低溫保存前后發芽率如圖6所示，當含水量為6.1%時，經超低溫保存后發芽率為91%，顯著高于該含水量下不經超低溫保存的馬尾松種子的發芽率86%，P=0.049（P<0.05）。這表明在最適含水量6.1%時，超低溫保存后對種子的發芽表現出了適度的“刺激”作用。

3?討論與結論

據報道，林木種子離體保存資金投入約是其樹上原位保存的1%（Li?&?Pritchard，2009），而作為離體保存方法之一的超低溫保存，能在較小的空間較低的成本下極大地延長材料的保存時間（Trajkovic'?et?al.，2019）。借助超低溫保存技術，正常型林木種子的保存壽命有望延長到百年及以上（Wang?&?Simpson，2006）。毫無疑問，超低溫保存是目前為止最經濟有效的長期保存種子資源的方法。種子的超低溫保存一般是將種子投入液氮一定時間（幾小時至幾年）取出化凍后采用TTC染色法監測材料的生活力或直接監測發芽率判斷該方法的適用性。馬尾松種子在液氮保存24?h后化凍后發芽率為91.33%，本研究不僅為馬尾松種子的長期保存提供了高效可行的方法，而且還為馬尾松種質資源超低溫庫的建設提供了理論依據和實踐指導，并為其他林木種子超低溫保存研究提供了借鑒。

植物的超低溫耐性與其脫水耐性、過冷卻能力和玻璃化能力密切相關（文彬，2011;Popova?et?al.，2012）。根據脫水耐性及儲藏能力種子被分為正常型、中間型、頑拗型三種類型。一般將能忍受脫水至含水量為0.05?g·g-1DW并能在0?℃以下低溫保存的稱為正常型種子，林木正常型種子成熟或脫落時含水量一般為20%～50%（Wang?&?Simpson，2006）。據此可明確馬尾松種子為正常型種子。正常型種子因為耐脫水，可以在冷凍前把自由水安全地移除，因此存在一個相對較寬的安全含水量范圍。對于這類種子FAO/IPGRI推薦的適合長期保存的含水量為4%～7%，本研究的結果與此相近。在3.2%～7.5%時，發芽率較高（在80%以上），因此認為3.2%～7.5%為馬尾松種子的安全含水量范圍，在這個范圍內既可以避免高含水量在零下低溫時造成的胞內結冰損傷又可以避免含水量過低引起的脫水損傷。本研究中，當含水量從6.1%升到15.8%時，發芽率緩慢下降（從91.33%降到69.33%），含水量大于15.8%時，發芽率急劇下降，但直到含水量升為22.7%時，發芽率仍高達34%。這與楊學軍（2008）的研究結果有些不同，雖然他指出當含水量超過15.6%時，馬尾松種子超低溫保存后發芽率急劇下降，但其結果顯示當含水率大于21.6%時，發芽率僅為2%。一般認為含水量是影響超低溫保存效果的主要因素之一。史鋒厚等（2005）研究認為含水量對超低溫保存效果的影響不顯著，其原因可能是試驗油松種子本身的含水量較低，已經在超低溫貯藏的適宜含水量范圍之內，加上其實驗設計的含水量梯度不大。本研究中，馬尾松種子初始含水量為9.56%，并通過干燥和浸種擴大其含水量梯度為3.2%～27.4%，結果證明雖然馬尾松種子超低溫保存安全含水量范圍較廣，但含水量仍然對影響超低溫保存效果有顯著影響。

胞內結冰是影響超低溫保存成功與否的關鍵因素之一。玻璃化狀態的形成理論上可以避免細胞內冰晶的形成（曾琳等，2014）。細胞內含物如可溶性糖、可溶性蛋白能提高植物的脫水耐性，降低過冷卻點，增強玻璃化能力（文彬，2011）。如喻方圓等（2006b）研究認為脂類對杉木種胚玻璃化狀態的形成十分重要。頑拗性種子易受超低溫傷害的主要原因是細胞代謝旺盛，線粒體、內膜系統豐富，液胞大而脂肪體，蛋白體和淀粉粒少（文彬，2011）。相反，Vertucci（1989）研究認為富含油脂的正常型種子易受超低溫傷害：一方面是貯油體與水分的相互作用會促進大冰晶的形成，導致電解質的泄露;另一方面是這類種子在凍存過程中容易因油體破裂導致生活力喪失。馬尾松種子富含油脂，其粗脂肪、粗蛋白質和總糖含量分別為44.8%、42.5%、7.1%（秦國峰等，2017b），但未發現油脂對其超低溫保存的不利影響，相反，在最適含水量6.1%時，經超低溫保存后馬尾松種子的發芽率較對照有所上升。這種超低溫保存對種子發芽的“刺激”作用，在人參（商麗煌等，2018）和一些野生花卉也有報道（王荷和劉燕，2011）。馬尾松種子內含物成分及含量與其耐受超低溫保存的關系，以及超低溫保存對其發芽率的“刺激”作用的機理機制有待于進一步研究。

超低溫保存對材料的傷害是一個累積的過程，冷凍階段的結冰和化凍階段的次生結冰都會導致機械損傷。因此，一般采取快速冷凍（曾琳等，2018）、快速化凍（Zhang?et?al.，2014）使材料迅速通過冰晶生長的溫度危險區。有研究認為大塊材料的快速升溫可能因為受熱不均勻發生機械傷害。本研究在含水量高的情況下，發現從液氮取出后，種子凍結成一整塊兒，推測這可能是高含水量種子發芽率低的原因之一。本研究采用直接投入液氮的快速冷凍和室溫空氣緩慢化凍的方法保存效果最好，42?℃水浴快速化凍發芽率較低，同時觀察到種子炸裂現象。此現象在合歡、祁州漏蘆等種子（王荷和劉燕，2011;何英虎等，2013）的研究中有報道，認為這種炸裂與種子含水量有關系，隨著含水量的降低，發生炸裂的種子比例增加。主要原因可能是種子承受不了冷凍和化凍過程中的巨大物理壓力而導致（何英虎等，2013）。這種炸裂對種胚產生的機械損傷可能是其低發芽率的原因之一。種殼能極大地提高種子在冷凍和化凍過程中所承受的物理壓力，減緩溫度變化對種皮的直接傷害而對種子起到保護作用，如在紅水櫻桃種子超低溫保存研究中，無種殼種子污染率高，發芽率低，且苗畸形（宋常美等，2019）。本研究認為種皮或種殼在超低溫保存中起到一定保護作用，去掉種皮的種子凍存后發芽率有所下降，且由于沒有種皮的保護，胚根和子葉的發育受到了影響，所以出現了形態不正常的幼苗。本研究通過降低化凍溫度，緩和化凍時種子內部發生的熱量交換有效地緩解了種子炸裂的問題。

總之，超低溫保存是目前為止種子資源長期保存最有效的方法。種子的超低溫耐性與其脫水耐性、過冷卻能力和玻璃化能力密切相關，而這些能力又受到種子特性（如大小、頑拗性程度、含水量、種皮結構、內含物組分）以及冷凍、化凍方式、冷凍保護劑作用、凍后的復水、回濕、吸漲吸水及恢復培養等各種因素影響。本研究證實了含水量、冷凍方式、化凍方式及種皮的保護作用等對馬尾松種子凍存效果的影響，確定了最適含水量和安全含水范圍，初步建立了馬尾松種子超低溫保存技術體系，獲得了高發芽率的長期保存方法，但其超低溫保存保護和損傷的機理機制仍不明確，需要進一步從生理生化和蛋白組學等方面開展研究。

參考文獻：

BASU?C，2008.?Gene?amplification?from?cryopreserved?Arabidopsis?thaliana?shoot?tips[J].?Curr?Iss?Mol?Biol，10（1-2）：55-60.

CHENG?LH，DUAN?XC，ZHANG?ZQ，et?al.，2012.?Cryopreservation?of?Chinese?Taxus?chinensis?seeds[J].?J?NW?A?&?F?Univ?（Nat?Sci?Ed），40（2）：71-78.[程利紅，段旭昌，張宗勤，等，2012.?中國紅豆杉種子超低溫保存技術研究[J].?西北農林科技大學學報（自然科學版），40（2）：71-78.?]

DENG?LX，LI?M，2009.?The?research?present?situation?and?prospects?on?the??Pinus?massoniana?Lamb.?plantation[J].?J?Anhui?Agric?Sci，37（7）：2968-2971.[鄧倫秀，李茂，2009.?馬尾松人工林研究現狀及展望[J].?安徽農業科學，37（7）：2968-2971.]

HE?YH，FU?YQ，LIU?Y，2013.?Cryopreservation?seeds?of?Albizzia?julibrissin?and?Picea?wilsonii[J].?Seed，32（3）：33-35.[河英虎，傅伊倩，劉燕，2013.?合歡和青杄種子超低溫保存研究[J].?種子，32（3）：33-35.?]

LI?DZ，PRITCHARD?HW，2009.?The?science?and?economics?of?ex?situ?plant?conservation[J].?Trends?Plant?Sci，14（11）：614-621.

LU?L，WANG?HY，TU?Y，et?al.，2013.?Cryopreservation?of?castanopsis?delavayi?seeds[J].?J?NE?For?Univ，41（7）：6-8.[盧玲，王海英，圖雅，等，2013.?高山栲種子的超低溫保存[J].?東北林業大學學報，41（7）：6-8.]

MA?J，YE?RY，ZHANG?JH，2019.?Study?on?the?cryopreservation?of?Cinnamomum?camphora?presl?mature?seeds[J].?J?Anhui?Agric?Sci，47（9）：170-172.[馬健，葉潤燕，張俊紅，2019.?樟樹成熟種子超低溫保存研究[J].?安徽農業科學，47（9）：170-172.]

MARCIN?M，BEATA?P?P，TADEUSZ?T，et?al，2015.?Desiccation?tolerance?and?cryopreservation?of?seeds?of?black?poplar?（Populus?nigra?L.），a?disappearing?tree?species?in?Europe[J].?Eur?J?For?Res，134（1）：53-60.

POPOVA?EV，HYUN?KD，HEE?HS，et?al.，2012.?Narrowing?of?the?critical?hydration?window?for?cryopreservation?of?Salix?caprea?seeds?following?ageing?and?a?reduction?vigour[J].?Cryoletters，33（3）：220-231.

QIN?GF，ZHOU?ZC，et?al，2012.?Germplasm?resources?of?Chinese?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：18-21.[秦國峰，周志春，等，2012.?中國馬尾松優良種質資源[M].?北京：中國林業出版：18-21.]

QIN?GF，ZHOU?ZC，JIN?GQ，et?al.，2017a.?Seed?orchard?of?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：304.[秦國峰，周志春，金國慶，等，2017a.?馬尾松種子園[M].?北京：中國林業出版社：304.]

QIN?GF，ZHOU?ZC，JIN?GQ，et?al.，2017b.?Seed?orchard?of?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：59.[秦國峰，周志春，金國慶等，2017b.?馬尾松種子園[M].?北京：中國林業出版社：59.]

SHANG?LH，LEI?XJ，SONG?J，et?al.，2018.?Study?on?Cryopreservation?of?Panax?ginseng?split?seeds[J].?Seed，37（7）：68-70.[商麗煌，雷秀娟，宋娟，等，2018.?人參裂口種子超低溫保存技術研究[J].?種子，37（7）：68-70.]

SHI?FH，YU?FY，SHEN?YB，et?al.，2005.?Cryopreservation?of?Chinese?pine?seeds[J].?J?Nanjing?For?Univ?（Nat?Sci?Ed），29（6）：119-122.[史鋒厚，喻方圓，沈永寶，等，2005.?超低溫貯藏對油松種子的影響[J].?南京林業大學學報（自然科學版），29（6）：119-122.]

SHI?J，LUO?YQ，ZENG?FY，et?al.，2005.?Impact?of?invasion?of?pine?wood?nematode?on?the?niche?of?main?populations?in?masson?pine?community[J].?J?Beijing?For?Univ，27（6）：76-82.[石娟，駱有慶，曾凡勇，等，2005.?松材線蟲入侵對馬尾松林主要種群生態位的影響[J].?北京林業大學學報，27（6）：76-82.]

SONG?CM，WEN?XP，LI?QH，2019.?Cryopreservation?of?seed?of?Prunus?pseudocerasu?L.?‘Hongshui?by?vitrification[J].?Seed，38（4）：156-158.[宋常美，文曉鵬，李慶宏，2019.?紅水櫻桃種子玻璃化超低溫保存[J].?種子，38（4）：156-158.]

SUN?HY，CAI?KX，WU?ZY，et?al.，1994.?Long-term?seed?storage?of?eight?main?forest?species?（Cunninghamia?lanceolata，Pinus?massoniana，etc.）?in?southern?China[J].?J?ZheJiang?For?Coll，11（3）：223-234.[孫鴻有，蔡克孝，吳祖映，等，1994.?杉木馬尾松等南方8個主要造林樹種種子長期貯藏[J].?浙江林學院學報，11（3）：223-234.]

TAN?J，2009.?Studies?on?physiological?changes?of?Cunninghamia?lanceolata?and?Pinus?massoniana?seeds?during?storage[D].?Nanjing：Nanjing?Forestry?University：1-88.[譚俊，2009.?杉木、馬尾松種子貯藏過程中的生理變化研究[D].?南京：南京林業大學：1-88.]

TRAJKOVIC'M，ANTONIC'D，CINGEL?A，et?al，2019.?Advancement?in?protocol?for?in?vitro?seed?germination，plant?regeneration?and?cryopreservation?of?Viola?cornuta[J].?Biotechnology，?9（1）：1-10.

VERTUCCI?CW，1989.?Relationship?between?thermal?transitions?and?freezing?injury?in?pea?and?soybeans[J].?Plant?Physiol，90（3）：1121-1128.

WALTERS?C，WHEELER?L，STANWOOD?P?C，2004.?Longe-vity?of?cryogenically?stored?seeds[J].?Cryobiology，48（3）：229-244.

WANG?BSP，SIMPSON?JD，2006.?Factors?affecting?tree?seed?storage[J].?J?Nanjing?For?Univ?（Nat?Sci?Ed），30（1）：1-7.

WANG?H，LIU?Y，2011.?Study?on?cryopreservation?of?25?kinds?of?wildflower?species?seeds[J].?Seed，30（4）：80-82.[王荷，劉燕，2011.?25種野生花卉種子超低溫保存研究[J].?種子，30（4）：80-82.?]

WEN?B，2011.?An?introduction?to?cryopreservation?of?plant?germplasm[J].?Plant?Diver?Resour，33（3）：311-329.[文彬，2011.?植物種質資源超低溫保存概述[J].?植物分類與資源學報，33（3）：311-329.]

WILDE?M，2015.?Cryopreservation?modern?insights[M].?New?York，USA：Callisto?Reference：97.

YANG?XJ，2008.?Studies?on?seed?glass?tansition?and?cryopreservation?of?three?coniferous?species[D].?Nanjing：Nanjing?Forestry?University：1-82.[楊學軍，2008.?三個針葉樹種種子玻璃與超低溫保存研究[D].?南京：南京林業大學：1-82.]

YANG?ZQ，2012.?Genetic?improvement?of?key?wood?and?resin?properties?of?Pinus?massoniana?Lamb[D].?Beijing：Beijing?Forestry?University：1-11.[楊章旗，2012.?馬尾松材性與產脂性狀遺傳改良研究[D].?北京：北京林業大學：1-11.?]

YU?FY，SHAO?L，SHEN?YB，2006a.?Studies?on?physiological?and?biochemical?changes?of?Chinese?fir?and?masson?pine?seeds?during?storage[J].?Sci?Silv?Sin，42（12）：137-142.[喻方圓，?邵嵐，沈永寶，2006a.?杉木、馬尾松種子貯藏過程中生理生化變化研究[J].?林業科學，42（12）：137-142.]

YU?FY，SHAO?L，CHEN?SF，2006b.?A?comparison?on?cytoplasmic?vitrification?and?freezing?point?of?Chinese?fir?and?masson?pine?seeds[J].?J?Nanjing?For?Univ（Nat?Sci?Ed），30（5）：1-4.[喻方圓，邵嵐，陳淑芬，等，2006b.?杉木、馬尾松種子細胞質凍結和玻璃化的比較[J].?南京林業大學學報，30（5）：1-4.]

The?State?Bureau?of?Quality?and?Technical?Supervision，2000.?Forest?seed?inspection?regulations?（GB2772-1999）[S].?Beijing：China?Standard?Publishing?House：10-15.[國家質量技術監督局，?2000.?林木種子檢驗規程?（GB2772-1999）[S].?北京：中國標準出版社：10-15.]

ZENG?L，HE?MJ，CHEN?K，et?al.，2014.?Study?on?cryopreservation?of?Alpinia?officinarum?Hance?seeds[J].?Chin?Agric?Sci?Bull，30（28）：164-168.[曾琳，何明軍，陳葵，等，2014.?高良姜種子超低溫保存研究[J].?中國農學通報，30（28）：164-168.]

ZENG?L，WU?Y，HE?MJ，et?al.，2018.?Physiological?and?biochemical?characteristics?of?Alpinia?oxyphylla?seeds?after?cryopreservation[J].?Guihaia，38（4）：529-535.[曾琳，吳怡，何明軍，等，2018.?超低溫冷凍對益智種子生理生化特性的影響[J].?廣西植物，38（4）：529-535.]

ZHANG?JM，ZHANG?XN，LU?XX，et?al.，2014.?Optimization?of?droplet-vitrification?protocol?for?carnation?genotypes?and?ultrastructural?studies?on?shoot?tips?during?cryopreservation[J].?Acta?Physiol?Plant，36（12）：3189-3198.

（責任編輯?蔣巧媛）