苞葉雪蓮中活性成分對EA.hy926細胞缺氧損傷的保護作用

葉 萍，李海麗,3*，林鵬程,3，許地元

(1.青海民族大學藥學院，青海西寧 810007；2.青藏高原植物化學重點實驗室，青海西寧 810007；3.青海省藥物分析重點實驗室，青海西寧 810007)

苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）為鳳毛菊屬雪蓮亞屬植物，別稱“苞葉鳳毛菊”，是高原地區特有的一種植物，性溫、微苦,能清熱解毒、祛風除濕、通經活血，藏醫用于治療癱瘓、癲癇、麻風病、瘡癤疔毒等[1-2]。我們在前期研究中發現苞葉雪蓮的粗提物對Na2S2O4造成的EA.hy926 細胞缺氧損傷具有保護作用[3]，但苞葉雪蓮中具體功效成分尚未明確。因此我們進行了進一步研究，發現苞葉雪蓮的抗缺氧活性部位是乙酸乙酯相中氯仿∶甲醇梯度洗脫比例中的10∶1 這一洗脫組分。我們將乙酸乙酯相的10∶1 組分再進行分離，將分離得到的單體化合物蘆丁、槲皮素繼續在細胞水平上進行抗缺氧活性實驗，探究其單體的抗缺氧活性，結果表明蘆丁、槲皮素為苞葉雪蓮抗缺氧作用的主要活性成分。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），96 孔板（Corning 公司），十萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司），CO2培養箱（三洋公司），超凈工作臺（東聯哈爾公司），Multiskan Spectrum 酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）。

1.2 試劑

連二亞硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；生理鹽水（國藥集團化學試劑有限公司）；培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、P/S（抗生素）均購買于Gibco 公司；DMSO（Sigma 公司）；CCK-8（Biosharp 公司）；98%濃硫酸、95%乙醇、甲醇、氯仿、石油醚和乙酸乙酯（分析純）均購自于天津市紅巖化學試劑廠；大孔吸附樹脂AB-8（南開大學化工廠）；葡聚糖凝膠LH-20（pharmacia）。EA.hy926細胞株購自上海細胞所。

苞葉雪蓮為2019年8月采于青?；ブ鄙?，經青海民族大學林鵬程教授鑒定為鳳毛菊屬雪蓮亞屬植物。經提取分離得到蘆丁、槲皮素單體化合物，實驗中用蒸餾水溶解稀釋為濃度分別為0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50 和0.006 25 mg/mL 的供試藥物。

2 實驗方法與結果

2.1 苞葉雪蓮有效部位的提取分離

將苞葉雪蓮粗提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相萃取物，分別濃縮，經活性初步篩選，發現乙酸乙酯部位具有活性，確定對乙酸乙酯部位進行分離純化。將浸膏用有機溶劑全部溶解，與100～200目的柱層析硅膠全部攪拌均勻，晾干后按體積比1(樣品)∶5(硅膠)裝柱并干法上樣。以氯仿-甲醇體系為洗脫體系，依次用氯仿∶甲醇體積比為100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、純甲醇梯度洗脫，洗脫液經分析合并，減壓濃縮分別得到7 個餾分，經活性篩選后發現活性部位為乙酸乙酯相的10∶1部位，以5∶1 的石油醚-丙酮體系洗脫得2 個組分∶Fr1 和Fr2，Fr2 經HPLC(30%甲醇-水)制備液相色譜分離乙酸乙酯相得化合物1和化合物2。經結構鑒定，化合物1為蘆丁，化合物2為槲皮素，共分離得到蘆丁5.6 mg，槲皮素11.2 mg。

2.2 細胞培養

取出凍存在液氮罐中的EA.hy926內皮細胞，復蘇。取適量細胞于T25 培養瓶中，加入4 mL 培養液，輕輕晃動培養瓶，使細胞混勻。將培養瓶置于培養箱中（37℃，5%CO2濕度飽和），24 h 后更換培養液，再過48 h 后觀察細胞形態，若適合傳代，則將細胞傳代，并接種在96 孔板中。傳代的細胞繼續培養或凍存，留待后續實驗使用[4]。

2.3 缺氧模型的建立

將EA.hy926 細胞接種于96 孔板中，調整細胞濃度至10 000/孔左右，每孔100 μL，放入培養箱培養24 h 后取出并觀察細胞形態。設立陰性對照組、缺氧組及給藥組，陰性對照組每孔加入10 μL 生理鹽水，缺氧組每孔加入100 mmol的Na2S2O410 μL（Na2S2O4的終濃度為8 mmol），給藥組每孔加入100 mmol的Na2S2O410 μL 及10 μL 不同濃度的單體化合物（蘆丁、槲皮素首濃度均為0.1 g/L，2 倍稀釋后得到下一濃度），放入培養箱中培養24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態在給藥前后的變化并拍照記錄。培養結束后每孔加入10 μL CCK-8，于培養箱中孵育30 min，在450 nm波長下觀察OD值[5-6]。

正常培養的EA.hy926 細胞為貼壁細胞，呈梭形，如圖1 所示。缺氧的EA.hy926 細胞受損，細胞邊緣模糊不清，細胞不再貼壁，呈畸形，細胞圓縮，大量死亡，部分死亡的EA.hy926細胞漂浮于培養基中，如圖2所示。蘆丁和槲皮素給藥組對EA.hy926細胞的缺氧環境有明顯改善，細胞存活較多，細胞形態良好，結果見圖3、4。

圖1 EA.hy926細胞正常形態觀察（×40）

圖2 EA.hy926細胞缺氧形態觀察（×40）

圖3 蘆丁給藥EA.hy926細胞形態觀察（×40）

2.4 CCK-8法檢測提取物對缺氧EA.hy926細胞的活性

圖4 槲皮素給藥EA.hy926細胞形態觀察（×40）

運用CCK-8 法檢測不同濃度蘆丁和槲皮素對缺氧EA.hy926 細胞的活性影響，在酶標儀450 nm波長下讀取OD 值，計算細胞存活率。通過數據分析可知，蘆丁、槲皮素具有較好的抗缺氧活性，結果如圖5～6。

圖5 蘆丁給藥細胞存活率

3 討論

本文主要針對苞葉雪蓮抗缺氧活性進行研究，通過細胞實驗對苞葉雪蓮的抗缺氧活性成分進行追蹤，最終確定其活性部位是粗提物的乙酸乙酯相中氯仿∶甲醇比例為10∶1時洗脫下來的組分，并從該組分中分離鑒定出蘆丁和槲皮素。通過細胞實驗分別對蘆丁、槲皮素單體化合物進行抗缺氧實驗，發現蘆丁、槲皮素具有較好的抗缺氧活性，與姚娟[7]、楊溢[8]和王赟[9]的研究成果一致。

圖6 槲皮素給藥細胞存活率

苞葉雪蓮粗提物中含有豐富的黃酮類化合物[10]。這些物質能夠調節造血系統功能、增強血液的攜氧能力[11]，保護心血管系統、提高缺氧時靜脈內皮細胞的活性[12]，提高機體抗氧化和清除自由基的能力，因此對缺氧引起的機體氧化損傷具有保護作用[13]。本實驗在一定程度上證明了文獻記載中苞葉雪蓮通經活血的功效。