miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的細胞活性及凋亡的影響

王 鵬， 左 斌， 唐家國， 何精選

(長江航運總醫院骨科， 湖北 武漢 430014)

下腰痛是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要癥狀，每年在全球影響數以百萬人的正常生活，這導致了重大的經濟和社會負擔[1,2]。因此闡明椎間盤退變的確切機制很重要，以便確定這種殘疾的新療法。miRNA在人類多種疾病中的重要調控作用得到很多研究的認可，其中包括椎間盤退變[3]。但是仍有部分新發現的miRNA在疾病中的功能仍待開發，如miR-663b在椎間盤退變中的功能尚未十分清楚。本研究旨在探索miR-663b對椎間盤退變髓核細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料:組織樣本來自本醫院2019年2月至2019年12月期間確診收治的人椎間盤退變患者22例及外傷致脊柱爆裂性骨折患者22例，所有患者和家屬均簽署知情同意書，并獲得本醫院醫學倫理委員會的批準。納入標準：年齡在60歲以下、臨床表現腰痛及一側下肢疼痛麻木、Lasegue陽性、DR和CT檢查顯示L4/5或L5/S1椎間盤突出；排除標準：腰椎滑脫、腫瘤、感染者，外傷引起的椎間盤突出者，患者心、肺、肝、腎功能障礙者。細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21)蛋白抗體CDKN1A購自上海雅吉生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteine aspartic protease，Caspase-3)兔多克隆抗體(ab44976)購自博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；細胞計數試劑盒(cell counting kit，CCK-8)購自Dojindo公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(membrane-linked protein V-fluorescein isothiocyanate/ propidine iodide，Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物研究所。所涉及的重組質粒、引物均送至上海吉瑪公司完成。

1.2方 法

1.2.1細胞的分離培養:參考張世磊等[4]的方法分離、培養人椎間盤髓核細胞。將清洗過的椎間盤組織用無菌組織剪剪碎，將其用0.25%胰酶消化1h，離心，收集沉淀細胞。將收集的細胞用20%的DMEM完全培養基在37℃、5%CO2的培養箱中培養、傳代。

1.2.2細胞分組:把正常培養的人椎間盤退變髓核細胞隨機分為對照組、低糖組、低糖組+miR-NC組、低糖組+miR-663b組、低糖組+anti-miR-NC組、低糖組+anti-miR-663b組。各個組的處理方式為：對照組，葡萄糖濃度為5mmoL/L的培養液培養人椎間盤退變髓核細胞48h；低糖組：葡萄糖濃度為1mmoL/L的培養液培養細胞48h；低糖組+miR-NC組(轉染miR-NC)、低糖組+miR-663b組(轉染miR-663b mimics)、低糖組+anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、低糖組+anti-miR-663b組(轉染anti-miR-663b)為用3倍重組質粒量的脂質體與質?；旌暇鶆?，在與低糖組細胞共培養5 h，繼續添加新培養液培養48 h，用qRT-PCR法檢測轉染的效率，確認轉染成功后方可用于后續實驗。

1.2.3qRT-PCR實驗:將充分研磨的組織或需要檢測的細胞用總RNA抽提試劑盒提取總RNA，再用反轉錄試劑盒合成cDNA，用作qRT-PCR實驗的模板。按照qRT-PCR試劑盒要求操作，結果以U6為模板，2-△△Ct法計算miR-663b的表達。反應條件為95℃，反應5min，95℃變性15s，60℃退火，延伸30s，共40個循環。引物為：miR-663b，5'-TATTTTATTAAGGGGGAAGTGT-3'，5'-CCTCRATAAAAAAACCTTCTCT-3'；U6，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4CCK-8實驗:將需要檢測的細胞用培養液調整至105個/mL，取其中100μL至于24孔板，再按照CCK-8試劑盒加入CCK-8反應液，結果在450nm波長下檢測細胞的吸光值(OD值)。

1.2.5Western blot實驗:收集需要檢測的細胞，提取總蛋白并定量。將蛋白用于SDS-PAGE蛋白電泳，再將膠上的蛋白轉移至PVDF膜。將帶有蛋白的膜用5%的脫脂奶粉封閉2h，再浸入一抗溶液(1∶1500)中4℃孵育過夜，次日再浸入二抗溶液(1∶1000)中37℃孵育2 h。最后，用電化學發光試劑盒對膜進行顯影曝光。

1.2.6流式細胞術實驗:將需要檢測的細胞洗滌3次后重懸，再用結合緩沖液懸浮細胞。按照Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒的要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反應10min后，上流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。細胞凋亡率為早期細胞凋亡率與晚期細胞凋亡率之和。

1.2.7統計學處理:實驗中所有數據均使用SPSS22.0進行分析，多組間數據的比較采用單因素方差分析聯合SNK-q檢驗，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1miR-663b在人正常椎間盤髓核組織和退變椎間盤髓核組織中的表達:運用qRT-PCR法檢測組織中miR-663b的表達水平，與人正常椎間盤髓核組織相比，人退變椎間盤髓核組織中miR-663b的表達水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 miR-663b在人正常椎間盤髓核組織和人退變椎間盤髓核組織中的表達

2.2過表達miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的細胞活性的影響：通過CCK-8法檢測細胞的OD值，Western blot檢測細胞中P21的蛋白表達。結果如圖1和表2所示，與對照組相比，低糖組人椎間盤退變髓核細胞中miR-663b表達顯著降低，細胞的OD值顯著降低，P21蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與低糖組+miR-NC組相比，低糖組+miR-663b組細胞中miR-663b表達上升，細胞的OD值明顯下降，P21蛋白表達量明顯升高(P<0.05)。

圖1 P21蛋白的表達

表2 過表達miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的細胞活性的影響

表3 過表達miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響

2.3過表達miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響：流式細胞術檢測細胞的凋亡，Western blot檢測細胞中Caspase-3的蛋白表達。結果如圖2和表3所示，與對照組相比，低糖組細胞凋亡率顯著升高，Caspase-3蛋白表達量明顯升高(P<0.05)；與低糖組+miR-NC組相比，低糖組+miR-663b組細胞凋亡率發生下調，Caspase-3蛋白表達量也發生下調(P<0.05)。

2.4抑制miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的細胞活性的影響：結果如圖3和表4所示，與對照組相比，低糖組細胞中miR-663b明顯降低，細胞的OD值也發生下降，P21蛋白表達量明顯上升(P<0.05)；與低糖組+anti-miR-NC組相比，低糖組+anti-miR-663b組細胞miR-663b表達、細胞的OD值和P21蛋白表達量則發生相反的調控作用(P<0.05)。

表4 抑制miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的細胞活性的影響

圖2 過表達miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響

圖3 P21蛋白的表達

2.5抑制miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響：結果如圖4和表5所示，與對照組相比，低糖組細胞中細胞凋亡率明顯升高，Caspase-3蛋白表達量發生升高(P<0.05)；與低糖組+anti-miR-NC組相比，低糖組+anti-miR-663b組細胞的凋亡率和Caspase-3蛋白表達量發生相反的調控作用(P<0.05)。

圖4 抑制miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響

表5 抑制miR-663b對低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響

3 討 論

本研究發現，miR-663b在人退變椎間盤髓核組織和低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞中的表達均發生明顯的下調。胡凱等[5]在研究中發現，miR-663b在退變椎間盤髓核組織中的表達發生明顯的下調，這與此實驗得到的結果相一致，但是，miR-663b在人椎間盤退縮中的功能尚未清楚。近期有很多研究報道，miRNA在椎間盤退縮中的調控功能，如miR-125b-1-3p、miR-200c等[6]。miRNA在人類機體的很疾病的發生發展中均具有重要的調控作用，由于miRNA發生作用的調控網絡異常復雜，因此其發揮作用的調控機制仍需探索。椎間盤退變的進展涉及多種復雜因素，例如炎癥、氧化應激、機械損傷和細胞衰老等[7]。

本研究發現，過表達miR-663b能夠促進低糖誘導的人椎間盤退變髓核細胞的增殖，抑制凋亡，并上調其中P21、Caspase-3的蛋白表達，抑制miR-663b則具有相反的作用。胡凱等[5]在研究中提示，MMP2能夠促進退變椎間盤細胞外基質的降解，促進椎間盤退變的發生，并且MMP2為miR-663b的直接靶標，也就是說，在椎間盤退變中由于miR-663b的下調，上調了MMP2的表達，間接促進了椎間盤的退縮。這暗示，miR-663b的模擬物對椎間盤退變的治療具有潛在的應用價值。這與此研究的觀點相吻合，均支持miR-663b在椎間盤退變過程中發揮積極的作用。不足之處為該實驗的結果尚未在動物體內得到更充分的驗證。P21在許多轉化細胞中受到p53通路的調控，細胞周期蛋白和CDKs在二元復合物中相互結合，形成細胞周期調控機制的核心。P21具有抑制細胞周期蛋白/CDK激酶的能力，并且過表達P21可能導致細胞周期的阻滯[8]。Caspase家族是細胞凋亡的核心。Caspase合成后以酶原的形式存在于細胞質中，在Caspase接收到相關的信號指令后發生連鎖反應，使Caspase被裂解和激活，進而導致信號級聯放大，激活多種下游蛋白酶，從而啟動多種凋亡通路。caspase的裂解是一個可逆的過程，caspase-3的激活是一個不可逆的過程，caspase-3是凋亡信號的最終執行者[9]。

綜上所述，miR-663b在椎間盤退變中異常下調，其可促進椎間盤退變髓核細胞的增殖，抑制凋亡，對椎間盤退縮的治療具有理論參考價值。