復方酮酸微丸膠囊的制備及其穩定性影響因素研究

徐 欣，劉哲鵬

(1.上海信誼金朱藥業有限公司技術中心，上海 201506;2.上海理工大學醫療器械與食品學院制藥工程教研室，上海 200093)

慢性腎病患者日常治療中，在低蛋白飲食的基礎上給予復方酮酸(含有氨基酸和酮酸)提供人體必需氨基酸，由于酮酸不含氨基，利用非必需氨基酸的氮在體內轉化為氨基酸，從而減少氮的攝入，減少尿素合成，避免因蛋白質攝入不足導致的營養不良[1]。這種治療方法在控制慢性腎病進程的臨床研究中取得了較大進展[2]。本研究的復方酮酸制劑中含有多種人體必需氨基酸及酮酸，包括L-醋酸賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、酮纈氨酸鈣、消旋酮異亮氨酸鈣、酮亮氨酸鈣、消旋羥蛋氨酸鈣和酮苯丙氨酸鈣，成分復雜。市場上已有的復方酮酸保健產品中的氨基酸和酮酸在儲存過程中含量下降，給用藥效果與用藥安全帶來隱患[3-4]。本研究根據相容性研究結果，將氨基酸和酮酸分別制成微丸，再裝填膠囊，得到復方酮酸微丸膠囊，為慢性腎病患者提供一種補充必需氨基酸的制劑，也為相關制劑的臨床開發奠定一定的理論基礎。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 WL-300型制丸機、LBL-1型流化床(重慶市科旭制藥機械設備制造有限公司)；安捷倫1200高效液相色譜儀(配DAD二極管陣列檢測器)、辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱[安捷倫科技(中國)有限公司]、氫型陽離子交換色譜柱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Milli-Q超純水機(美國密理博公司)。

1.2 藥品和試劑 醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸(無錫晶海氨基酸有限公司)；酮纈氨酸鈣、消旋酮異亮氨酸鈣、酮亮氨酸鈣、消旋羥蛋氨酸鈣、酮苯丙氨酸鈣(開原亨泰制藥有限公司)；預膠化淀粉(卡樂康包衣材料有限公司)；交聯聚維酮、聚維酮K30(美國國際特品公司)；滑石粉(桂林桂廣滑石開發有限公司)；醋酸賴氨酸對照品、蘇氨酸對照品、色氨酸對照品、組氨酸對照品、酪氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院)；酮纈氨酸鈣對照品、消旋酮異亮氨酸鈣對照品、酮亮氨酸鈣對照品、消旋羥蛋氨酸鈣對照品、酮苯丙氨酸鈣對照品(上海理工大學醫療器械與食品學院自制)；四氫呋喃、甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為優級純。

2 方法和結果

2.1 氨基酸含量測定

2.1.1 氨基酸溶液的配制 取待測樣品(氨基酸顆?；驈头酵嵛⑼?，研細，混勻后取適量，精密稱定，置100 ml量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液適量，溶解，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液。另分別稱取組氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸和醋酸賴氨酸對照品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并配制成濃度為0.2、0.25、0.15、0.1和0.5 mg/ml的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.2 氨基酸含量測定的色譜條件 采用辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：取1.64 g醋酸鈉，加0.18 ml三乙胺和3 ml四氫呋喃，加水至1000 ml，混勻，用1%的醋酸溶液調節pH值至7.2；流動相B：取1.64 g醋酸鈉，加200 ml水使溶解，用1%的醋酸調pH值至7.2，加入400 ml乙腈和400 ml甲醇，混勻，進行梯度洗脫：0～10 min流動相A 90%→80%，10～20 min流動相A 80%→50%，20～25 min流動相A 50%→20%，25～26 min流動相A 20%→0%，26～27 min流動相A 0%→90%，27～30 min流動相A 90%；柱溫40 ℃；檢測波長338 nm[5]。

2.1.3 樣品處理和進樣檢測 分別取氨基酸對照品溶液和供試品溶液按以下方法進行柱前衍生化和進樣檢測。(1)硼酸緩沖液的配制：取2.48 g硼酸和1.14 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100 ml，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至10.2，備用。(2)鄰苯二甲醛(OPA)溶液的配制：稱取120 mg OPA，加1 ml乙腈和7 ml硼酸緩沖液(pH 10.2)溶解后，加入150 μl的3-巰基丙酸，混勻，備用。(3)系統適用性實驗：吸取10 μl硼酸緩沖液，2 μl的OPA溶液，2 μl氨基酸對照品溶液或供試品溶液，將14 μl溶液以最大速度混合，按2.1.2項下色譜條件進樣檢測，得到5種氨基酸的HPLC譜圖，見圖1。出峰順序依次為組氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸，理論塔板數按組氨酸峰計算≥3000，相鄰色譜峰之間的分離度均>1.5。

2.2 酮酸含量測定

2.2.1 酮酸溶液的配制 取待測樣品(酮酸顆?；驈头酵嵛⑼?，研細，混勻后取適量，置250 ml量瓶中，加水適量溶解，定容，搖勻，濾過，作為供試品溶液。另分別稱取酮纈氨酸鈣、消旋酮異亮氨酸鈣、酮亮氨酸鈣、消旋羥蛋氨酸鈣和酮苯丙氨酸鈣對照品適量，分別用水溶解并配制成濃度為0.05、0.04、0.06、0.04和0.04 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 酮酸含量測定的色譜條件 采用氫型陽離子交換色譜柱(380 mm×7.8 mm，9 μm)；精密吸取0.67 ml濃硫酸，加水稀釋至1000 ml，即得0.012 5 mol/L的硫酸溶液作為流動相；檢測波長205 nm；流速0.5 ml/min；柱溫25 ℃[6]。

2.2.3 系統適用性實驗 精密量取酮酸供試品溶液和對照品溶液各10 μl，注入HPLC儀，得到5種酮酸的HPLC譜圖(見圖1)。理論塔板數按酮苯丙氨酸鈣計算≥2000，相鄰色譜峰之間的分離度均>1.5。

2.4 標準曲線的繪制

2.4.1 氨基酸的標準曲線 分別稱取醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸對照品52.54、26.64、11.37、19.12和15.26 mg，置20 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液適量使溶解，稀釋至刻度，作為對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，作為系列濃度標準曲線工作液。按2.1.2項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。以峰面積(A)對濃度(c)進行線性回歸，計算標準曲線，得到醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸的線性回歸方程見表1，結果表明5種氨基酸在線性范圍內線性關系良好。

表1 氨基酸和酮酸含量測定的方法學考察結果

2.4.2 酮酸的標準曲線 分別精密稱取28.94 mg酮纈氨酸鈣對照品、24.09 mg消旋酮異亮氨酸鈣對照品、33.25 mg酮亮氨酸鈣對照品、17.56 mg消旋羥蛋氨酸鈣對照品和18.54 mg酮苯丙氨酸鈣對照品，置50 ml量瓶中，加水適量，超聲使對照品完全溶解，定容，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5、1、2、5、8、10和12.5 ml，分別置50 ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，作為系列濃度標準曲線工作液，按2.2.2項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

以各組分的峰面積(A)對濃度(c)進行線性回歸，計算標準曲線，得到酮纈氨酸鈣、消旋酮異亮氨酸鈣、酮亮氨酸鈣、消旋羥蛋氨酸鈣和酮苯丙氨酸鈣的線性回歸方程見表1，表明5種酮酸在線性范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗 精密量取供試品溶液，重復進樣6次，結果5種氨基酸和5種酮酸的RSD均<2%(見表1)，表明精密度良好。

2.6 重復性實驗 按2.1.1項和2.2.1項下方法，分別配制氨基酸或酮酸對照品溶液和6份供試品溶液，按2.1.2項和2.2.2項下色譜條件，測得5種氨基酸和5種酮酸含量的RSD均<1.5%(見表1)，表明方法重復性良好。

2.7 回收率實驗 (1)氨基酸的回收率：按處方組成稱取各種輔料和酮酸，混勻后作為模擬空白輔料，將模擬空白輔料分別加入到標示含量為80%、100%和120%的各種氨基酸對照品中，每組平行3份，加0.1 mol/L鹽酸溶液使主成分溶解，過濾，作為供試品溶液。按2.1.2項下色譜條件進樣，測得各種氨基酸含量測定的平均回收率在98.62%～100.45%，表明氨基酸的回收率良好。(2)酮酸的回收率：按處方組成稱取各種輔料和氨基酸，混勻后作為模擬空白輔料，將模擬空白輔料分別加入到標示含量為80%、100%和120%的各種酮酸對照品中，每組平行3份，加水使主成分溶解，濾過，作為供試品溶液。按2.2.2項下色譜條件，測得各種酮酸含量測定的平均回收率在99.14%～101.45%，表明酮酸的回收率良好。

2.8 穩定性實驗 精密量取供試品溶液，每2 h測定一次，連續測定12 h，結果5種氨基酸和5種酮酸的RSD均<2%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.9 相容性實驗 將5種氨基酸和5種酮酸共10種組分混勻，另分別將5種酮酸混勻，將5種氨基酸混勻，將混勻后樣品進行影響因素試驗(高溫60 ℃)，以相對于0 d的性狀和含量變化作為考察指標。10種組分混合樣品、5種氨基酸混合樣品以及5種酮酸混合樣品的高溫相容性實驗結果見表2。10種組分混合樣品在60 ℃放置10 d，性狀由白色粉末變為黃色粉末。由表2可見，醋酸賴氨酸、色氨酸、酮亮氨酸鈣和酮苯丙氨酸鈣的含量有顯著變化。而5種氨基酸、5種酮酸分別制粒后混合，60 ℃放置10 d，各種氨基酸和酮酸的含量和混合物的性狀均無明顯變化。由此可見，酮酸和氨基酸之間存在相互作用，因此為保證微丸中藥物穩定性，本研究考察了將氨基酸和酮酸分別制顆粒、再混合后的影響因素試驗，結果見表2。將酮酸與氨基酸分別制顆粒后，60 ℃放置10 d，各組分含量均無明顯變化，說明將氨基酸與酮酸分別制粒，樣品相容性較好。因此，本研究將氨基酸和酮酸分別制丸，裝填膠囊，以保證其穩定性。

表2 氨基酸和酮酸混合樣品在高溫60 ℃的相容性 (%)

2.10 微丸的制備

2.10.1 氨基酸微丸的制備 取處方量的醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸(見表3)，過80目篩，混勻，取部分混合物，加入5%聚維酮K30溶液制軟材，過60目篩制粒，流化床干燥，60目篩網整粒，收集60～80目顆粒，置于制丸機中。開動制丸機，以7 ml/min流量噴入15%聚維酮K30乙醇溶液，同時不斷加入剩余混合物，制丸?？刂旗F化壓力<0.3 MPa，轉速250～350 r/min，溫度35 ℃～45 ℃，加料結束后，維持制丸機溫度15 min，加入適量滑石粉混勻。

表3 復方酮酸微丸膠囊的處方組成 (mg/粒)

2.10.2 酮酸微丸的制備 取處方量的酮纈氨酸鈣、消旋酮異亮氨酸鈣、酮亮氨酸鈣、消旋羥蛋氨酸鈣、酮苯丙氨酸鈣及輔料(見表3)，過80目篩，混勻，取部分混合物，加入5%聚維酮K30溶液制軟材，過60目篩制粒，流化床干燥，60目篩網整粒，收集60～80目顆粒，置于制丸機中。開動制丸機，以7 ml/min流量噴入10%聚維酮K30乙醇溶液，同時不斷加入剩余混合物，制丸?？刂旗F化壓力<0.3 MPa，轉速250～350 r/min，溫度35 ℃～45 ℃，加料結束后，維持制丸機溫度15 min，加入適量滑石粉混勻。

2.10.3 復方酮酸微丸膠囊的制備 分別取上述氨基酸微丸和酮酸微丸，裝填膠囊，制備得到每粒含氨基酸微丸270 mg、酮酸微丸460 mg的復方酮酸微丸膠囊。

2.11 影響因素試驗 將制備得到的復方酮酸微丸膠囊進行高溫(60 ℃)、高濕(相對濕度92.5%)和強光照射(4500 Lx)影響因素試驗，0、5和10 d取樣，檢測各組分含量變化，結果見表4。由表4可見，復方酮酸微丸膠囊在上述條件下放置10 d，各組分穩定性良好。

表4 復方酮酸微丸膠囊含量的影響因素試驗結果 (%)

3 討 論

本研究發現，復方酮酸組分中的醋酸賴氨酸、色氨酸、酮亮氨酸鈣與酮苯丙氨酸鈣之間存在相容性配伍問題，因此在制備工藝中采用將氨基酸和酮酸分別制丸后再裝填膠囊的方式，可以較好地解決復方產品組分的穩定性問題。有研究表明，高溫、高濕、強光照射、原輔料相容性因素等會影響產品質量[7]，在產品開發中，首先應通過相容性研究，明確各組分在高溫、高濕和強光照射等外界苛刻條件下的穩定性以及處方中各組分是否存在相容性問題，再以此為基礎選擇合適的工藝條件開發產品，從而可以有效確保復方制劑的產品質量。本研究制備的復方酮酸微丸膠囊穩定性良好，可用于慢性腎病患者必需氨基酸的補充。