同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定小麥粉中黃曲霉毒素B1的不確定度評定

楊 濤，袁 輝

(新疆產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830011)

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉、寄生曲霉產生的次生代謝產物[1]，在濕熱地區食品和飼料中出現黃曲霉毒素的幾率很高。它們存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是容易污染花生、玉米、小麥等糧油產品，是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。

黃曲霉毒素 B1是黃曲霉毒素的產物中對人體最具威脅的物質，具有致癌、致突變和致畸形作用。目前，檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法[2]， 高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法[3-4]，以及酶聯免疫吸附測定法[5]等。本研究按照2016年12月發布的GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[6]中第一法：同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法，對小麥粉中黃曲霉毒素B1進行測定，并依據 CNAS—GL 06《化學分析中不確定度的評估指南》和 JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[7-8]規定的方法建立了數學模型，分析了液相色譜-串聯質譜法測定小麥粉中黃曲霉毒素B1過程中所引入的不確定度來源，并對各個不確定來源進行了分析、量化處理，得出小麥粉中黃曲霉毒素B1含量的擴展不確定度，對其最終測定結果進行不確定度評估，為小麥粉中黃曲霉毒素B1的測定結果的準確性提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標準品，含量標示為(100.54±0.3)μg/ml，純度為99%，Pribolab公司；同位素內標13C17-黃曲霉毒素B1標準品，含量標示為(0.501 ± 0.008) μg/ml，純度為99.3%，Pribolab公司；甲醇，色譜純，Fisher公司；乙酸銨，色譜純，sigma公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，華安麥科；小麥粉為市場購買。

1.2 儀器與設備

AB 4000+高效液相色譜-質譜/質譜儀，美國AB公司； 色譜柱：島津C18色譜柱，150 mm×2.1 mm，3 μm；Sartorius BSA22025電子天平，感量0.01 g，德國Sartorius公司；固相萃取裝置，美國J2 Scientific公司；5418離心機，德國Eppendorf；超純水機，美國millipore公司。

1.3 方法

1.3.1標準溶液的配制

移取黃曲霉毒素B1標準品1.00 ml于10 ml容量瓶，甲醇定容為標準儲備液。移取儲備液0.5 ml于50 ml容量瓶，定容為標準工作液。移取13C17-黃曲霉毒素B1標準品2 ml于10 ml容量瓶，作為同位素內標工作液。準確移取工作液10、100、300、500、1 000 μl至10 ml容量瓶中，加入200 μl同位素內標工作液，甲醇定容至刻度，得到內標質量濃度為2 ng/ml的標準使用液。

1.3.2樣品前處理

準確稱取試樣5.00 g于離心管中，加入100 μl內標，震蕩后靜置30 min。加入(7+3)甲醇水20 ml，超聲提取20 min。6 000 r/min離心10 min，取上清液4 ml，加25 ml水稀釋，將待凈化液注入免疫親和柱中，調節壓力以6 ml/min的流速過免疫親和柱，直至2～3 ml空氣通過柱體。準確加入1 ml色譜甲醇洗脫，流速為1～2 ml/min，收集全部流出液于樣品瓶中，經0.22 μm濾膜過濾，供測試使用。

1.3.3儀器分析條件

流動相為5 mmol乙酸銨溶液∶甲醇，流速0.3 ml/min，柱溫40℃，進樣量：10 μl。質譜條件：電噴霧正離子掃描模式，多反應監測模式(MRM)見表1。

表1 多反應監測條件

1.3.4數學模型的建立與不確定度來源的分析

1.3.4.1不確定度的評估

不確定度的評估需要明確測量值的數學模型，進而分析其可能的不確定來源。本實驗中黃曲霉毒素B1的數學計算模型如式(1)所示：

(1)

式中，X為試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；m為試樣質量，g；V1為 樣品提取液總體積，20 ml；V2為免疫親和柱上樣體積，4 ml；V3為樣品定容體積，1 ml；c為從標準曲線上測得試液中黃曲霉毒素B1的質量濃度，ng/ml；f為樣品加標回收率，%。

1.3.4.2不確定度分量的主要來源及其分析

該方法前處理過程主要為手工操作，受人為因素影響較大。根據檢測方法和實際操作情況，高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1不確定度主要有以下幾個來源：一是標準溶液引入的不確定度，包括標準物質純度引入的不確定度，標準溶液稀釋配制過程引入的不確定度，最小二乘法擬合標準曲線產生的不確定度；二是樣品前處理過程引入的不確定度，包括樣品稱量、提取溶劑的總體積、免疫親和柱上樣體積和最終定容體積以及提取效率和樣品回收率引入的不確定度。

2 結果與分析

2.1 標準溶液引入的不確定度(c)[9-11]

黃曲霉毒素B1標準溶液引入的不確定度主要由標準物質自身純度、標準工作液稀釋配制過程以及標準曲線擬合等引入。

2.1.1標準物質自身純度引入的不確定度(s)

根據標準證書可得知，黃曲霉毒素B1和同位素內標13C17-黃曲霉毒素B1的含量分別為100.54±0.3 μg/ml和0.501±0.008 μg/ml(k=2)，按照均勻分布計算，由標準物質純度引入的相對不確定度分別為：

urel(s1)=0.03÷(100.54×2)=0.001 49

urel(s2)=0.008÷(0.501×2)=0.007 98

因此，由標準物質純度引入的不確定度為：

2.1.2標準溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的不確定度(D)

2.1.2.1標準溶液稀釋過程中體積引入的不確定度(V)

標準溶液配制的過程中使用了一系列的移液器和玻璃量器，依據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》和JJG 646—2006《移液器檢定規程》[12-13]所明示，對本實驗中所使用的移液器和玻璃量器均有相應的最大允許誤差，按照矩形分布，標準溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的相對不確定度見表2。

表2 標準溶液配制過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度

在標準溶液稀釋配制過程中，使用10 ml容量瓶7次，100 ml容量瓶1次， 1 000 μl移液器移取1 000 μl體積4次，1 000 μl移液器移取500 μl體積1次，300 μl移液器移取300 μl體積1次，100 μl移液器移取100 μl體積1次，10 μl移液器移取10 μl體積1次，200 μl移液器移取200 μl同位素內標體積5次。由表2中的數據合成標準溶液稀釋過程中，移液器和玻璃量器引入的相對不確定度為：

=0.053

2.1.2.2標準溶液稀釋過程中溫度波動引入的不確定度(T)

移液器和玻璃量器的鑒定是在20℃下進行，配制標準溶液的溫度要控制在(20±5)℃，因此，可以通過估算溫度范圍和體積膨脹系數，計算由溫度波動引入的不確定度。由于玻璃的膨脹系數遠遠小于液體的膨脹系數，所以玻璃的膨脹系數可忽略不計。標準溶液是用甲醇稀釋配制的，甲醇在20℃時的膨脹系數為1.19 ×10-3ml/℃，溫度變化按照矩形分布，各移液器和玻璃量器因溫度波動引入的不確定度見表3。

表3 標準溶液配制過程中溫度引入的不確定度

根據表3中的數據，以及移液器和玻璃量器使用次數，合成標準溶液稀釋過程中，溫度變化引入的相對不確定度：

=0.015

因此，標準溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的不確定度為：

=0.055

2.1.3最小二乘法擬合標準曲線引入的不確定度(q)

標液系列的質量濃度為0.1、1、3、5、10 ng/ml，內標的質量濃度均為2 ng/ml，在液相色譜-串聯質譜儀上對五個校準標準溶液各測量3次，共計15次，得到各質量濃度標準物質所對應的峰面積比值。標準曲線數據如表4，用最小二乘法擬合各標準溶液質量濃度與峰面積比值的標準曲線。

表4 內標法測定黃曲霉毒素B1標準曲線的數據

對被測樣品溶液中的的黃曲霉毒素B1共測量2次，即p=2。根據峰面積，由標準曲線方程計算得到樣品中黃曲霉毒素B1平均質量濃度為x=4.3 ng/ml。于是由最小二乘法擬合標準曲線引入的不確定度u(q)為

=0.176 6

其中：

由標準曲線擬合的相對不確定度為：

urel(q)=u(q)/x=0.041

因此，樣品在測定過程中，由標準溶液引入的不確定度為：

2.2 樣品前處理過程引入的不確定度[10,14]

2.2.1樣品稱量過程引入的不確定度(m)

天平校準的允許最大誤差為0.01 g，標準要求稱樣質量為5.00 g，按矩形分布原則，稱樣時由天平的最大允許誤差導致的樣品質量不確定度為

2.2.2添加內標溶液引入的不確定度(I)

采用100 μl移液器加入內標13C17-黃曲霉毒素B1標準溶液100 μl，由移液器引入的相對標準不確定度為：

urel(I)=uT6rel=0.011 5

2.2.3樣品提取液總體積(V1)

樣品提取液使用25 ml量筒量取(7+3)甲醇水20 ml，JJG196—2006《常用玻璃量器》[12]規定：20℃時25 ml量筒的容量允許誤差為±0.25 ml，按矩形分布，則量筒量取提取液體積引來的不確定度分量為：

2.2.4免疫親和柱上樣體積(V2)

使用5 ml移液器移取4 ml提取液進行免疫親和柱法，按照JJG 646—2006《移液器檢定規程》[13]：20℃時5 ml移液器在5 ml檢定點的最大允許誤差為0.6%，按矩形分布，則免疫親和柱上樣體積引來的不確定度分量為：

2.2.5樣品定容體積(V3)

樣品最終定容使用1 ml單標線移液管移取色譜級甲醇進行定容，按照JJG 646—2006《移液器檢定規程》[13]：20℃時1 ml移液器在1 ml檢定點的最大允許誤差為0.1%，按照矩形分布，則樣品定容體積引來的不確定度分量為：

2.2.6提取效率和過小柱得到的回收率影響(f)

如1.3.2所述，測定小麥粉中的黃曲霉毒素B1的前處理需經過對樣品的稱量、提取、上柱凈化、洗脫定容等步驟后經儀器分析測試。在這冗長的過程中必然會造成樣品的測定值偏離真值。本實驗對樣品進行6次平行測試，根據6次結果進行計算，回收率結果見表5。

表5 回收率結果統計

根據表5的數據，回收率的相對標準偏差為4.0%，因此由樣品回收率引入的相對不確定度為：

urel(f)=0.040

2.3 分析儀器引入的不確定度(E)

本實驗所采用的超高效液相色譜-串聯質譜儀的擴展不確定度為5%，k=2(由新疆自治區計量測試研究院出具的校準證書)，則由液相色譜-串聯質樸儀引入的相對不確定度為：

urel(E)=0.05÷2=0.025

2.4 測量不確定度的評定與報告

2.4.1合成標準不確定度

各相對不確定度分量見表6。

表6 各相對不確定度分量匯總表

由表6可以看出，小麥粉中黃曲霉毒素B1的相對標準不確定度分量貢獻較大的分別是標準溶液的稀釋配制、標準曲線擬合以及提取效率和過小柱得到的回收率，而樣品稱量、樣品提取液體積等引入的相對標準不確定度相對較小。

由表6中的數據合成標準不確定度：

=0.084

2.4.2擴展不確定度

依據JJF1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[15]規定，在95%置信水平下，取包含因子k為2，小麥粉中黃曲霉毒素B1的測量值為4.3 ng/ml，按照前處理過程，計算得到小麥粉中黃曲霉毒素B1的含量為4.30 μg/kg，則擴展不確定度

U= 4.30×0.084×2 =0.72 μg/kg

2.4.3測定結果

按照該方法測定小麥粉中黃曲霉毒素B1的結果為：X=(4.30±0.72)μg/kg，k=2。

3 結論

在報告測量的結果時，必須給出相應的不確定度，一方面便于使用它的人評定其可靠性，另一方面也增強了測量結果之間的可比性。

本研究根據實驗過程建立數學模型，對小麥粉中黃曲霉毒素B1測定過程中的各個不確定度來源進行了量化分析。結果發現，影響黃曲霉毒素B1測定的不確定度的主要因素，主要來源于標準溶液稀釋過程，其百分比高達27.73%；其次是最小二乘法標準曲線擬合以及提取效率和過小柱的回收率引入的不確定度，均在20%以上；而樣品稱量以及前處理過程中定容體積等引入的不確定度相對而言都比較小。

看似對檢測結果影響不大的標準溶液稀釋過程，因為有內標的加入，稀釋的步驟越多，所產生的不確定度越大，從而增大了不確定度因素。因此，在小麥粉中黃曲霉毒素B1測定過程中，要著重加強不確定分量中百分比最大的三個方面的質量控制，從而降低測量不確定度，使測定結果的準確性得以提高。