α-酮酸檢測方法的研究進展*

楊 陽，劉雪懿，焦淑玲，高文運

（1.西安醫學院 藥學院 藥物研究所，陜西 西安710021；2.西北大學 生命科學學院國家微檢測系統工程研究中心，陜西 西安 710069）

α-酮酸（Alpha-keto acid）是一種具有雙官能團的生物活性物質，涉及生物代謝和機體多種生理病理過程，可作為有機合成和生物合成的中間體，廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等領域[1]。

近年來，α-酮酸在機體代謝調控和疾病診斷治療方面的作用越來越受到重視。例如在腎病的防治方面，α-酮酸與低蛋白飲食搭配可以用于減緩慢性腎炎的發展進程，通過減少內源性尿素生成和炎癥反應等措施，不僅降低了患者蛋白尿的排泄，而且提高了機體的抗氧化能力，有效緩解氧化自由基對細胞及機體的損傷，還改善了患者體內電解質紊亂現象，起到保護腎功能作用[2,3]。此外，丙酮酸（PA）具有增強心臟功能的作用，可以用于感染性休克的靜脈復蘇，也是心力衰竭的冠狀動脈內輸液和體外循環心臟停搏液中的一種成分，還能保護心臟免受因缺血再灌注或氧自由基暴露而造成的可逆性損傷（如昏迷）[4]。不僅如此，由于腫瘤細胞中糖酵解活性增強，使PA水平升高，故PA水平測定可作為口腔癌或其他惡性腫瘤的篩查工具[5]。在最新對PA的研究中，提出以PA為靶點的治療策略可適用于多種組織癌癥的治療[6]。還有一類常見的α-酮酸是α-酮戊二酸（AKG），AKG能夠調節機體的能量代謝，具有促進機體生長，維持腸道健康，改善骨質等多種生理功能[7]。α-酮酸還可用于氨基酸代謝先天缺陷疾病的診斷，如楓糖漿尿癥（MSUD）、苯丙酮尿癥（PKU）、高蛋氨酸血癥、酪氨酸血癥。

由于α-酮酸的上述作用，其檢測方法對于疾病的診斷治療，生物代謝過程研究具有重要意義。本文主要描述α-酮酸的各種檢測方法在生物學研究和醫藥研究方面的應用，并闡述其優勢、應用范圍以及檢測時需要注意的問題。

1 α-酮酸的檢測方法

1.1 氣相色譜-質譜聯用

氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）檢測方法的選擇性好，靈敏度高，但由于α-酮酸不具備揮發性，需要進行衍生化反應。最早使用的衍生化試劑為2,4-DNPH、五氟苯肼（pentafluorophenyl-hydrazine），所生成的衍生物會以順反異構體形式存在不易被分離。而另一種試劑OPD形成的衍生化產物的揮發性差。為了解決上述問題，可以采用兩步衍生化法。例如α-酮酸先與OPD生成喹喔啉類成分，再進行硅烷化，常用的硅烷化試劑是N，O-雙（三甲基硅基）氟乙酰胺（BSTFA）（見圖 1（1），Figure1（1））[8]。但由于硅的同位素會產生背景干擾，故選用不含硅元素的衍生化試劑替代，例如N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛（DMF-DAA）（見圖 1（2））。后為了簡化衍生步驟，Matsukawa等人[9]使用N-苯基-1,2苯二胺（NPhe-PDA）（見圖2）作為衍生化試劑，產物1-苯基-3-甲基喹喔啉-2-酮（1-phenyl-3-methylquinoxalin-2-one）滿足GC-MS的分離和檢測條件。

圖1 （1）喹喔啉與N，O-雙（三甲基硅基）氟乙酰胺反應（2）喹喔啉與N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛反應Fig.1 （1）Quinoxaline reacts with BSTFA（2）Quinoxaline reacts with DMF-DAA

圖2 α-酮酸與N-苯基-1,2苯二胺反應Fig.2 α-keto acid reacts with N-Phe-PDA

此外，為了有效地避免硅同位素干擾，實現高靈敏度的檢測[10]，Nguyen等人[11]采用氣相色譜-質譜選擇離子監測（SIM）模式對硅烷化的衍生物進行檢測，該實驗對衍生化條件進行優化，提高了α-酮酸衍生物的穩定性，并在質譜掃描和SIM兩種模式下對衍生物進行分析，每個化合物的3個特征離子用于峰確認，而一個目標離子用于定量，得到了易被檢測的特征離子，可以提高檢測靈敏度，在一定程度上避免復雜樣品（人的尿液、血漿和大鼠腦組織液）的基體干擾，實現了樣品中17種酮酸的定性定量分析。

1.2 毛細管電泳

毛細管電泳（CE）是近30年來發展起來的新型分離技術[12]，是基于在電場中離子遷移速度的不同來實現各組分分離。由于苯丙酮酸具有電活性，CE與紫外檢測器聯用可實現生物樣品中苯丙酮酸的分離檢測[13]，從而對苯丙酮尿癥進行無創診斷。CE還可與安培檢測器聯用測定苯丙酮尿癥患者尿液中的苯丙酮酸和苯乙酸，實現了患者尿液中兩種標志成分的同時測定[14]。此外，還可以對汗液中的丙酮酸進行分析，樣品可不經預處理，具有分析速度快、操作簡便等優點[15]。

1.3 高效液相色譜

高效液相色譜（HPLC）基于傳統液相色譜采用高壓輸液系統，使樣品中各成分實現高效快速的分離。不僅能夠滿足藥物分析、疾病檢測等方面α-酮酸的測定需求，也可應用于環境中α-酮酸的監測。通過聯接不同的檢測器，是現在對各種樣品中α-酮酸進行檢測的主流技術。

1.3.1 示差折光檢測器 示差折光檢測器（RID）是一種通用型檢測器，是利用組分與流動相折射率之差對待測成分進行檢測，對糖類和有機酸的檢測靈敏度較高，該檢測器可以用于發酵液中α-酮酸的檢測。付永前等人[16]在檢測米根霉富馬酸發酵液中有機酸（如AKG）的實驗中提到，之所以使用RID進行測定，是由于發酵液中的尿素、脂類等培養基成分在有機酸檢測波長范圍內均有較強的吸收，使用紫外檢測器進行分析時易受到干擾，而培養基成分在RID中的出峰不影響對目標物質的檢測。所建液相方法在AKG濃度0.05～10g·L-1范圍內線性關系良好，r=0.9996，其檢測限為 10mg·L-1。

1.5.2 熒光檢測器 熒光檢測器（FD）可用于檢測能產生熒光或其衍生物能發熒光的物質，其靈敏度比紫外檢測器要高，是對血漿、細胞類等生物樣品中α-酮酸分析常用的檢測器之一。使用FD對α-酮酸進行檢測時，由于α-酮酸不能產生熒光，需要對其進行衍生化反應，能使α-酮酸產生熒光的試劑有OPD、1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯（1,2-diamino-4,5-methylenedioxy-benzene，DMB）（見圖 3）、4'-肼基-2-二苯乙烯（4'-Hydrazino-2-stilbazole,4H2S）（見圖4）等。其中最常使用的是OPD，它在2mol·L-1的鹽酸中對α-酮酸進行衍生，在50℃下加熱30min，所得衍生物熒光發射波長410nm，激發波長在350nm。所得含量測定結果批內、批間變異系數均小于10%，回收率在90%～110%之間[17]。這種衍生化試劑相較其他熒光衍生化試劑反應速度較快，而且對α-酮酸具有較好的選擇性。但OPD對光敏感，易氧化，所以Fuchs等人[18]在使用OPD前要在100～120℃與正庚烷重新結晶，且OPD溶液要新鮮制備。

圖3 α-酮酸與1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯反應Fig.3 α-keto acid reacts with DMB

圖4 α-酮酸與4'-肼基-2-二苯乙烯反應Fig.4 α-keto acid reacts with 4H2S

1.5.3 紫外檢測器 紫外檢測器（UVD）是測定生物樣品中α-酮酸常用的檢測器，在使用這種檢測器時，一般情況下會對α-酮酸進行衍生化，以便于得到分離度高、響應值強的分析圖譜。例如在測定血漿中 α-酮戊二酸（AKG）時，選用 2,4-DNPH，2-硝基苯肼（2-NPH）作為衍生化試劑[19]。但二者所得衍生化產物均會以順反異構體的形式存在,相比氣相色譜，高效液相色譜分離效率更高，使衍生物的順反異構體能得到較好的分離。但與2-NPH反應生成的異構體需在不同波長下檢測，方法不夠便捷。除這種衍生化試劑外，常用的衍生化試劑還有OPD，以及一些新型衍生化試劑，例如Khalida P.Mahar等人[20]使用1，2-二氨基-1，2-二苯乙烷（1,2-diamino-1,2-diphenylethane SDA）（見圖5）進行柱前衍生，pH值為3.2和T=100℃條件下，反應30min，于255 nm處進行檢測。Makahleh等人[21]也采用了新型衍生化試劑 2，4，6-三氯苯肼（2,4,6-trichloro phenyl hydrazine，TCPH）（見圖6），并且對尿液樣品預處理條件進行優化，可得到更加準確的檢測結果。

圖6 α-酮酸與2，4，6-三氯苯肼反應Fig.6 α-keto acid reacts with TCPH

還可以選擇不經衍生化進行HPLC測定。例如果酒[22]、水果[23]等樣品在測定PA或AKG時，通過向流動相加入緩沖鹽或酸，并調節適宜pH值，選擇合適的流速和柱溫進行梯度洗脫，可以實現待測成分的分離。除此之外，還可以選擇向流動相中加入離子對試劑進行分離。陶國慶等人[24]在測定細胞內AKG含量時，通過向流動相中加入離子對試劑四丁基氫氧化銨（TBAH），調節pH值為4，使待測的AKG成分與其他細胞代謝物得到較好分離，在214nm處進行測定。該方法線性方程相關系數高，AKG含量的相對標準偏差為0.38%,平均回收率達99.38%。此外，尿液等樣品中復方α-酮酸片的有效成分也可不經衍生化實現測定，其中黃小雅等人[25]運用離子對色譜法對尿液中復方α-酮酸片的4種酮代氨基酸鈣進行檢測，選用乙腈、20mmol·L-1NaH2PO4緩沖液和15mmol·L-1TBAH為流動相，調pH值為7.0，在210nm處檢測，經驗證4種成分在20～200mg·L-1范圍內線性關系良好，平均回收率在86.79%～112.00%。

在運用離子對色譜檢測基礎上，Zaifa等人[26]提出了樣品前處理的優化對尿液中復方α-酮酸片的4種酮代氨基酸鈣檢測的重要性，他們對尿液進行三相中空纖維液相微萃取，這種純化方法對有機溶劑的消耗較少，而且具有較高的富集作用，是一種環保、高效的樣品制備方法。樣品經處理后，減少了尿液中內源性物質的干擾，提高了檢測的靈敏度。經驗證四種α-酮酸類成分在0.1～10mg·L-1內均有較好線性關系，含量的相對標準偏差均小于6.27%，加標回收率在 92%～118%，檢測限為 5.8～100.7μg·L-1，富集倍數在11～202之間。

1.5.4 質譜檢測器 液相色譜與質譜聯用在近些年在α-酮酸檢測方面應用廣泛，Francisco等人[27]采用HPLC-MS測定豬肉和伊比利火腿中α-酮酸的含量，進一步說明α-酮酸對發酵類食品香味的影響。在使用HPLC-MS測定生物樣品中α-酮酸時，往往不需要衍生化，這樣大大縮減了檢測時間，而且避免了一些因衍生化而產生的干擾。這時液相方法的關鍵是色譜條件和質譜參數的選擇。在Ruiting等人[28]所發表文獻中，運用電噴霧電離正負離子測定，并且采用同位素標記內標物進行定量，消除因生物基體效應所造成的影響，提高檢測的靈敏性。Zhang等人[29]在測定血清和肌肉中的支鏈酮酸時，選擇用甲醇提取，能有效去除蛋白，并對提取液進行濃縮，采用高分辨質譜（HRMS）進行測定，提高了檢測的靈敏度和準確性。

超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是在原有高效液相色譜的基礎上，對儀器整體系統進行優化，使分析效率大大提高。例如細胞內的α-酮酸與苯肼（phenyl hydrazine）的衍生化產物，經UPLC分離后通過電噴霧質譜進行檢測，使用同位素示蹤法對其衍生物及衍生物異構體進行測定。這種檢測技術相比傳統的液相色譜-質譜聯用，可實現更加高效、快速的分析。黃琪等人[30]使用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS）可以同時測定生物樣品中三羧酸循環中間體（如AKG）。其檢測限低于60nM，回收率大于95%。

1.6 其他方法

除上述方法外，還有核磁共振技術、酶反應分析、電化學方法、傳感器分析檢測等方法也被用于檢測α-酮酸。

1.6.1 核磁共振技術 J.E.A.等人[31]發表的文獻中提到，NMR可用于啤酒中有機酸的定量，對啤酒中發現的6種主要酸（包括丙酮酸）進行了不同的核磁共振方法的比較。與傳統的積分方法相比，偏最小二乘法（PLS）回歸的使用使定量更快，并且研究了使用不同參考方法（毛細管電泳，直接和間接紫外檢測，以及酶促分析）建立PLS模型的性能。核磁共振積分結果與PLS積分結果基本一致，這些結果使PLS-NMR方法成為啤酒中有機酸定量的一個有趣的選擇。

1.6.2 酶反應分析 酶反應分析是通過酶促反應將α-酮酸轉化為易被紫外檢測的成分，進行定量分析。比如Theerasak等人[32]曾報道過的，用酶動學方法測定醫療產品和運動補充劑中的AKG，不需要比色探針或偶聯反應就可以建立AKG含量測定的標準曲線，在20～160μM范圍內具有良好的線性關系，檢測限為4.09μM，定量限為13.62μM。這種方法具有檢測快速，專屬性好，不需要繁瑣的樣品處理，對環境無影響等優點，適用于質控實驗室的AKG的常規分析。

1.6.3 電化學法 黃穎等人[33]將電化學法用于對羥基苯丙酮酸（pHPP）的檢測，根據pHPP在碳納米管修飾電極上的電化學行為進行分析，考察了多種因素對測定的影響。使用修飾電極通過差分脈沖伏安法進行測定，pHPP響應值較裸玻碳電極檢測有明顯的增強，經驗證pHPP氧化峰電流強度與其濃度大小在 5×10-12～1×10-10mol·L-1范圍內呈較好的線性關系，檢測限為 1.36mol·L-1。

1.6.4 傳感器技術 傳感器技術是現在的一個研究熱點，由于其分析方法簡單、響應時間短、檢測結果靈敏度高等特點，該技術可應用于PA的測定。檢測PA的傳感器種類有酶傳感器[34,35]、比色傳感器[36]、無酶傳感器[37]。酶傳感器檢測的優點就是對待測成分專屬性很強，這種檢測器檢測為避免干擾響應，會在丙酮酸氧化酶敏感電極上加上多離子絡合雙層體系[34]，或是采取更簡便的措施，在探針上固著一層由丙酮酸氧化酶與戊二醛形成交聯的不溶膜，然后在表面覆蓋一層聚四氟乙烯膜[35]，這樣既避免干擾，又降低成本。然后是比色傳感器，這種傳感器檢測原理是由于PA可以使 C-rich DNA轉換為i-基序DNA，從而失去保護金納米粒子（AuNPS）免受鹽誘導聚集效應的能力。通過加入丙酮酸脫羧酶（PDC）將PA轉化為乙醛和CO2，使溶液pH值由酸性變為中性，C-rich DNA可以保持原有狀態，并保護AuNPS免受鹽誘導聚集效應。通過向樣品加入PDC前后的吸光度差值可以定量PA，其檢測限為3.0μM[36]。最近被用于該領域的是無酶傳感器，這是一種用PA分子印跡聚合物（PA-IP）對碳糊電極（CPES）進行修飾的傳感器，PA-IP不僅可以在電極表面富集PA，使目標化合物信號增強，而且能有效地與草酸、檸檬酸等干擾物質信號分離。這種傳感器可在較寬濃度范圍內和亞微摩爾水平上測定PA，檢測限為0.1～200μM，并實現了血樣和尿樣中PA的測定[37]。

2 結論

α-酮酸作為糖、蛋白質、脂質代謝過程中的重要成分，在生物學研究方面，α-酮酸是生物代謝過程中的關鍵成分，一些α-酮酸在生物體內進入三羧酸循環，為生物體提供能量。通過對α-酮酸的含量分析，能夠對生物代謝過程有更進一步的認識。在臨床實踐方面，由于α-酮酸與氨基酸的相互轉化和一些疾病的產生密切相關，因此，通過對血液、尿液、組織液等生物樣品中α-酮酸的含量測定，可以用于疾病診斷。在藥物合成方面，因α-酮酸結構的特殊性，它可作為一些藥物的合成中間體，所合成藥物被用于治療慢性腎病、惡性腫瘤、高血壓等疾病。通過藥物中α-酮酸的含量測定，可以對藥物質量進行控制。綜上所述，α-酮酸的檢測方法對于生物學研究、臨床實踐等領域都有著非常重要作用。

近幾十年現代分離分析方法的快速發展，使α-酮酸檢測方法不斷完善，從而加速了α-酮酸的研究進程。液質聯用的應用范圍較廣，而且能得到精密準確的檢測結果，是目前α-酮酸的主流檢測手段。此外，一些正在研究開發的新技術在α-酮酸的檢測中也取得了較好的結果，這些檢測手段的持續發展將會有助于未來醫藥和生物學領域中α-酮酸的進一步研究。