Zn2+對EGCG的結構和抑菌活性的影響

苗嘉桐， 侯興棟， 夏思遠， 鄧憶美， 付維哲， 孫鐵英 ， 姜 濤*

(1. 大連醫科大學基礎醫學院 生物技術系，遼寧 大連 116044；2.大連醫科大學 附屬第二醫院，遼寧 大連 116044)

結核病是由結核分枝桿菌引起的呼吸道傳染病。據統計，2017年全球因結核病死亡人數達到130萬，新發病例數約100萬[1]。因此，成功研發新一代抗結核藥是目前需要解決的難題之一。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是茶多酚的主要成分[2]，在抗衰老、抗菌以及防治癌癥等多方面具有重要作用[3]。但受自身理化性質的限制，其生物活性不能充分發揮，存在脂溶性差、生物利用率低、生理環境下不穩定和體內吸收緩慢等問題，在醫藥領域應用中受到限制。因此，對EGCG進行分子修飾已勢在必行。茶多酚具有大π鍵的共軛體系強配位的氧原子與合適的空間構型，可以作為金屬離子的良好配體，為茶多酚的分子修飾提供了理想的結構基礎。目前研究表明，金屬離子對茶多酚的抗氧化活性、抗腫瘤作用具有一定影響[4-6]。近年來研究證實，中草藥中的有機成分與金屬離子結合后，其生物活性提高，甚至可以產生新的藥理作用[7]。鋅是人體生長發育不可缺少的金屬元素，廣泛參與細胞代謝，是許多酶發揮活性的必要輔助因子，具有穩定蛋白質高級結構的作用，也被用作生物抗氧化劑。EGCG與鋅鹽反應后生成的化合物可能兼有EGCG和Zn的雙重生物活性，使其應用更為廣泛。前期研究發現，EGCG能夠抑制恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatismc2155)的生長[8]。本研究發現，EGCG與LB液體培養基相互作用，誘發EGCG代謝物的產生。進而擬用鋅鹽制備EGCG金屬化合物，揭示鋅鹽對EGCG結構、理化特性和生物學活性的影響，為EGCG的進一步研究開發提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 恥垢分枝桿菌Mycobacteriumsmegmatismc2155菌株(本實驗室保存)。

1.1.2 主要試劑 綠茶(購自陜西省商南縣)；EGCG標準品(購自浙江乾盛康藥業有限公司)；醋酸鋅二水合乙酸鋅(分析純AR500 g，西隴化工化學試劑公司)。

1.1.3 儀器與設備 Binary HPLC Pump高壓液相色譜儀(JEOL)；Hypersill BDS C18色譜柱(Thermo)；pHs-3C型精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)；GSKP01隔水式電熱恒溫培養箱(湖北省黃石市醫療器械廠)；FD-1B-50低溫真空冷凍干燥機(北京博醫康)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 EGCG處理前后恥垢分枝桿菌生長曲線的測定 挑取M.smegmatismc2155/pSMT1單菌落，接種在5 mL含40 μg/mL潮霉素的LB液體培養基中，37 ℃孵育24 h。以LB培養基為對照(control)，以終濃度為20 μg/mL EGCG的LB培養基為處理組，按1∶100接種菌液并在37 ℃培養，從第10小時起每4 h取出菌液200 μL，加入2 μL 1%的十二奎醛作為細菌熒光素酶的底物，鋪在白色不透明的96孔板中進行熒光檢測，用M.smegmatis/pSMT1校正過的線性標準曲線處理數據，繪制野生型恥垢分枝桿菌和20 μg/mL的EGCG處理下的生長曲線[9]。

1.2.2 HPLC和LC/MS方法檢測EGCG的含量和結構 野生型恥垢分枝桿菌中加入終濃度為20 μg/mL的EGCG，37 ℃培養48 h，每間隔6 h取6 mL菌液，其中5 mL菌液進行100 W 超聲2 s，間隔2 s，共5次超聲處理。分別進行8 000 g離心10 min，保留上清備用。利用Hypersill BDS C18色譜柱系統檢測EGCG的含量。洗脫程序如下：流動相A，2%乙酸；流動相B，乙腈；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；加樣量10 μL。用LB培養基配制EGCG標準品作為對照,濃度0.02 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后按HPLC洗脫程序進行操作。利用HPLC檢測EGCG的含量，LC/MS方法鑒定恥垢分枝桿菌處理18 h后EGCG的結構變化。

1.2.3 EGCG-Zn2+的化學合成及紫外吸收分光光度法鑒定 將0.65 g的EGCG標準品溶于10 mL蒸餾水中，采用pHs-3C型精密pH計，加入1 mol/L的NaHCO3溶液調節pH為7[10]，在磁力攪拌器攪拌下緩慢加入1.25 g鋅鹽，反應30 min，靜置30 min，然后過濾，洗滌。洗滌后的上層清液用NaHCO3檢驗直至無沉淀生成，經抽濾過后，得到深紅褐色產物，用玻璃棒小心剝離，烘干后得產物。通過化學試劑沉淀法，將所得到的深紅褐色產物用稀H2SO4溶解后，取少量在試管中，加入NaHCO3溶液，觀察試管中沉淀情況，進行初步鑒定。多酚類物質由于含有苯環結構，對其進行檢測通常采用紫外吸收光譜法。將EGCG標準品和化學合成所得的深紅褐色產物，分別以無水乙醇稀釋，使其終濃度均為3×10-5mol/L,在200～300 nm之間，每隔10 nm測其吸光度，并繪制曲線。

1.2.4 紙片瓊脂擴散法檢測抑菌作用 將EGCG標準品和化學合成產物分別用甲醇配制成濃度為2 mg/mL的儲存液，經0.22 μm濾器過濾除菌后，加入EP管中保存備用。然后在每個EP管中放入滅菌后的濾紙片，浸泡過夜，第2天放入烘箱烘干，于4 ℃保存備用。按1∶200稀釋恥垢分枝桿菌菌液，取50 μL菌液滴于平板上，均勻涂抹，在平板上小心放入之前準備好的濾紙片，并進行相應標記。平板經室溫放置5 min后，倒置于37 ℃恒溫培養48 h，觀察EGCG和EGCG-Zn2+作用下的抑菌圈大小，上述實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 EGCG對恥垢分枝桿菌的抑制作用

由圖1可知，與對照組(control)相比，20 μg/mL的EGCG處理組對恥垢分枝桿菌生長具有明顯抑制作用，EGCG處理10 h后出現抑制作用，18 h抑制作用最為明顯，18 h以后抑制作用明顯減弱。

2.2 恥垢分枝桿菌培養基中EGCG含量變化

隨著EGCG處理時間延長，恥垢分枝桿菌培養基上清中EGCG含量逐漸下降，直到30 h后，培養上清中不能檢測到EGCG。EGCG處理恥垢分枝桿菌后30 min 培養上清中EGCG含量出現明顯變化，推測EGCG可能與恥垢分枝桿菌細胞壁相互結合有關。利用超聲處理方法，使其黏附于細胞壁上的EGCG重新釋放到培養基中，再進行檢測。分別取EGCG處理后6、18和24 h的樣品進行超聲處理后進行HPLC檢測。結果表明， EGCG處理6 h后，超聲處理前后培養上清中EGCG含量無明顯變化； EGCG處理18 h后，超聲處理導致培養基中EGCG含量明顯變化(圖2)。由此可見，培養基中EGCG含量的減少可能是因為EGCG黏附在細胞壁的表面，也可能經過代謝或與其他離子結合而使特定結構的EGCG含量減少[11]。

圖1 EGCG處理的恥垢分枝桿菌的生長曲線

2.3 恥垢分枝桿菌培養基中EGCG的結構變化

EGCG的分子量為458.4。LC/MS結果表明，EGCG對照組在m/z為457 [M-H]-處出現明顯峰值，與相應分子量的EGCG相對應。

圖2 超聲處理前后的培養基中EGCG含量比較分析Fig.2 The comparative analysis of EGCG content in culture mediumbefore and after ultrasonic treatment

EGCG與恥垢分枝桿菌作用后，EGCG質譜圖中,在1.18、3.35、3.53 min 三個時間點出現峰值分別進行質譜鑒定。與對照組相比，m/z出現127.8、199.1、382.9、453、473以及489特異性峰值。這些分子可能是EGCG與LB培養基中離子結合后的產物,如473[M+OH]-等,也有可能是EGCG的代謝產物。為驗證EGCG的離子結合能力及其影響，選用鋅離子做進一步研究。

2.4 EGCG-Zn2+的化學合成及分析

經一系列化學反應后，得到深紅褐色產物，初步鑒定為EGCG-Zn2+，但其中含有大量白色固體，應為未反應的乙酸鋅或碳酸鋅。經分離稱量，本研究中，EGCG-Zn2+合成率為16.3%。紫外吸收光譜法鑒定結果表明，高于200 nm處的較強吸收是由于芳環中π-π*躍遷引起的，是芳香化合物的特征吸收帶，眾多的酚羥基是影響EGCG紫外吸收的主要因素。EGCG分子結構中存在較多的酚羥基，它的λmax出現在波長200～300 nm。

EGCG標準品與EGCG金屬化合物的最大吸收波長和吸收強度有所不同，但EGCG-Zn2+在紫外光區仍有明顯的酚羥基吸收(圖3)。研究結果表明，EGCG和EGCG-Zn2+的紫外吸收光譜明顯不同，也證明了EGCG-Zn2+的合成。進一步HPLC分析顯示，EGCG標準品的主要峰值保留時間為6.621 min，峰面積所占比例為46.98%；而EGCG-Zn2+主要峰值保留時間為9.079 min，峰面積所占比例為47.98%(圖4)。所以，EGCG與Zn2+作用后，出峰時間明顯變化。

圖3 EGCG和EGCG-Zn2+的紫外吸收光譜Fig.3 The ultraviolet absorption spectrum of EGCG and EGCG-Zn2+

圖4 EGCG和EGCG-Zn2+的HPLC分析

2.5 EGCG和EGCG-Zn2+抑菌作用的比較

采用紙片瓊脂擴散法比較EGCG與EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌抑菌作用。結果表明，2 mg/mL的EGCG標準品和2 mg/mL的EGCG-Zn2+均出現抑菌圈現象，抑菌圈直徑分別為16 mm和12 mm。表明在該濃度下，EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌具有一定的抑菌作用，但其抑菌作用明顯弱于EGCG標準品。

3 討 論

近年來，茶多酚的抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等生物活性研究已被廣泛報道，但EGCG金屬化合物的生物學活性研究報道較少。最近研究發現，天然產物或藥物經金屬離子修飾后活性發生變化[12-13]。許多金屬離子對于人體的正常生長發育是至關重要的，而天然產物或藥物經金屬離子修飾后可能兼顧兩者的性質，達到更好的作用效果[14]。例如，納豆激酶(Nattokinase,NK)是一種新型食源性纖溶酶，具有很強的溶血栓作用，實驗證實，經Mg2+修飾，提高了納豆激酶的活性，增強了其穩定性[15]。另外，金屬離子修飾糖類化合物后可作為食品功能因子廣泛應用于食品工業和農業，具有無污染、水溶性好、陰離子性等特性，是生物體金屬補充劑的很好選擇，具有重要生物意義[16]。

恥垢分枝桿菌是結核分枝桿菌的模式菌，具有相似的細胞壁結構。前期研究表明，綠茶粗提物及其主要成分EGCG能抑制恥垢分枝桿菌的生長[8]。本研究表明，EGCG的含量和結構容易受內外因素影響，在恥垢分枝桿菌培養液中，發現了EGCG的不同代謝物，在Zn離子作用下，EGCG出峰時間延長，說明其結構可能發生變化。而鋅是一種重要的微量元素，正常人體內含鋅約2～3 g，它對于人體正常成長和發育是必不可少的[15]。已有資料表明，鋅鹽已作為一種藥物應用于臨床[16]。將鋅鹽與EGCG結合形成新型EGCG來研究對恥垢分枝桿菌的抑菌作用將對EGCG的進一步開發利用提供參考。研究結果表明，EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌具有抑菌作用，但該作用明顯減弱。有文獻報道，在體外抗氧化實驗中，茶多酚鋅的抗氧化能力明顯強于茶多酚[17]。因此，鋅鹽雖然加強了EGCG的抗氧化能力，但卻降低了其對恥垢分枝桿菌的抑菌作用，這些都為今后研究新型EGCG金屬化合物，如EGCG-Ag+提供了思路。

1965年，Moyer研究發現硝酸銀溶液對葡萄狀球菌、鏈狀球菌等有抗菌活性[18]。用途最廣的是磺胺嘧啶銀，它作為一種抗菌劑被廣泛用于嚴重燒傷時的抗菌消毒以防止細菌感染[19-20]?；粽摰萚21]合成了新的外用抗菌藥物氟哌酸銀，它具有強大的廣譜殺菌作用。因此，Ag離子可能會大大加強EGCG的抑菌作用，為將來研究新型抗結核病藥物(EGCG-Ag+)制劑提供了寶貴的思路。