內蒙古錫林郭勒冬季放牧蒙古牛腸道微生物多樣性和功能預測分析

阿日查 斯木吉德 王純潔 張 劍 陳 浩 劉 波 何利娜 張 晨 崔銀雪 敖日格樂*

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院，呼和浩特 010018； 2.內蒙古農業大學 獸醫學院，呼和浩特 010018)

蒙古牛是一個古老的馴化畜種，其祖先為亞洲野牛[1]。原產于蒙古高原地區,現廣泛分布于內蒙古、新疆和甘肅等地區。在內蒙古地區，錫林郭勒盟的蒙古牛數量最多，錫林郭勒草原屬北部溫帶大陸性氣候，主要氣候特點是風大、干旱和寒冷[2]。年平均氣溫3.1 ℃，寒冷期長達7個月，1月氣溫最低，極端最低氣溫可達-42.4 ℃，為華北最冷的地區之一。在極為寒冷的冬季，牧草雖處于枯草期，但自然放牧且無補飼條件下蒙古牛依然正常生存，并具有較高的生產性能和遺傳穩定性[3]。經當地牧民長期適應性選擇后，蒙古牛逐漸形成了抗寒、抗病、耐粗飼和適應性強等特點，這些優良特征使其成為蒙古高原的優勢畜種之一。

哺乳動物的腸道是一個復雜的生態系統，由多種多樣的微生物群組成[4]。腸道菌群是機體正常菌群的重要組成部分，它們對宿主的疾病或健康狀態下的發生及發展有著密切的關系[5]。與宿主漫長的進化過程中，可直接參與宿主食物的消化、能量代謝和營養吸收等多種生理活動，相當于一個后天的重要器官[6-7]。目前，腸道微生物在草食性反芻動物中研究較為廣泛，如綿羊[8]、牦牛[9]和肉牛[10]等。健康機體的腸道菌群相對穩定，但由于飲食、環境(溫度變化)及季節的不同，其菌群多樣性會發生動態變化[11-15]。淡瑞芳等[16]在研究不同季節綿羊瘤胃菌群結構的季節性動態變化時發現，其冬季瘤胃細菌豐度顯著低于秋季。劉春朋等[17]研究表明，急慢性冷應激會改變鵪鶉十二指腸內腸道菌群的數量和種類。冷應激3、6和12 h時鵪鶉十二指腸內逐漸出現新的菌群且產生了波動性的變化。在急慢性冷應激時，雛雞腸道大腸桿菌呈逐漸增多，而乳酸桿菌含量下降[18]。Li等[19]比較春季和夏季奶牛的糞便微生物多樣性時發現，夏季熱應激時，微生物豐度Chao1和ACE指數呈下降趨勢，夏季的Shannon和Simpson多樣性指數明顯低于春季，春季奶牛糞便中微生物的種類數量高于夏季，該研究揭示動物腸道微生物多樣性受季節因素的影響。然而，在自然放牧而無補飼條件下，季節因素對蒙古牛腸道微生物多樣性的影響迄今尚未報道。本研究以冬季自然放牧而無補飼條件的蒙古牛腸道微生物為研究對象，利用16S rRNA Illumina Hiseq測序，監測食物短缺的冬季放牧蒙古牛腸道菌群多樣性及結構的變化，以期為深入研究放牧蒙古牛腸道微生物的組成與營養物質的消化吸收和腸道健康之間的關系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 采樣地點及時間

分別于2018年11月28日、12月27日和2019年1月30日在內蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗滿都拉圖鎮某牧戶家的牧場進行樣品采集。

1.2 試驗動物及糞便樣品采集

內蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗滿都拉圖鎮某牧戶家提供的20頭3～4齡健康無病的放牧蒙古母牛為試驗動物。其常年自然放牧，自由采食牧草和飲水，無補飼情況。采集蒙古牛新鮮直腸糞樣于無菌管中，放置液氮罐送回實驗室于-80 ℃，待檢。

1.3 牧草樣品采集

跟隨放牧牛群，采集(1.0 m×1.0 m)樣方牧草(芨芨草、錦雞兒、沙蔥和針茅)。除去雜質將其自然風干，帶回實驗室粉碎，進行牧草營養成分的測定。其測定方法參照張麗英[20]的《飼料分析及飼料質量檢測技術》。

1.4 采樣地點氣候特征

表1 試驗地點氣候特征Table 1 Climatic characteristics of study site

1.5 糞便樣品高通量測序分析

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對糞便樣品基因組DNA進行提取[21]，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，擴增其 16S rRNA V3～V4高變區，特異性引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴增及Illumina Hiseq測序均由北京諾禾致源科技股份有限公司協助完成。

1.6 生物信息

操作單元OTU聚類分析數據經過濾和質控后，對所有樣品的全部有效序列進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為1個操作分類單元(OTUs)。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法進行物種注釋分析，在門和科分類水平上，統計樣品的物種豐度和多樣性。

LEfSe是一種基于線性判別分析(Linear discriminant analysis,LDA)效應量(Effective size)[22]的分析方法，其本質是篩選關鍵的生物標記物。LEfSe能自動對各分類水平的組成進行統計分析，并將其可視化，默認設置線性判別分析值(LDA Score)的篩選值為4。

利用QIIme(Version 1.9.1)軟件計算α多樣性，包括Chao1指數、ACE 指數、Shannon指數和Simpson指數。其中Chao1指數和ACE 指數計算菌群豐度，Shannon指數和Simpson指數計算菌群多樣性。

利用β多樣性分析評價樣品在物種復雜性方面的差異，對OTU數據進行主坐標分析(Principle coordination analysis，PCoA),使用層次聚類方法非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構建系統發育樹，對距離矩陣進行解釋，結合細菌群落柱狀圖，研究不同組間或樣品間的菌群相似性和分類學差異性。

PICRUSt(Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)是基于以測細菌16S rRNA的測序數據，對糞便微生物的基因進行功能預測[23]。

1.7 統計分析

試驗數據先用Excel進行前期處理，后使用SPSS 20.0進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同時間點牧草營養成分的變化

由表2可知，11月份牧草中的粗蛋白和酸性洗滌纖維顯著高于其他時間點(P<0.05)；中性洗滌纖維顯著低于其他時間點(P<0.05)。次年1月份牧草中的中性洗滌纖維最高，粗蛋白最低。牧草中中性洗滌纖維的含量隨著試驗時間的變化逐漸增加，粗蛋白、粗脂肪和酸性洗滌纖維的含量隨著試驗時間的變化逐漸減少，粗脂肪含量在各時間點差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同時間點混合牧草的營養水平Table 2 Nutrient levels of mixed pastures at different time points %

2.2 不同時間點蒙古牛腸道微生物α多樣性指數

基于Illumina HiSeq 測序平臺對細菌16S rRNA基因V3～V4高變區測序分析，60份樣品平均每個樣品測得90 075條有效序列，經過質控平均得到 83 870條序列，質控有效數據量達63 802條序列，質控有效率達70.81%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到3 975個OTUs，對OTUs序列與Silva132數據庫進行物種注釋。注釋結果中，84.60%的OTU注釋到門水平，65.08%的OTU注釋到科水平，29.56%的OTU注釋到屬水平。

通過繪制稀疏曲線來評判測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性(圖1)，隨著測序深度的增加，在測序量達到30 000時，曲線趨向平坦，說明取樣的數量合理，測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種，且能夠很好地反映出所有樣品的細菌群落結構和多樣性。

不同的樣品用不同顏色的曲線表示Different samples were represented by different color curves圖1 60份樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of 60 samples

表3顯示了不同時間點放牧蒙古牛腸道菌群α多樣性指數，直接反映微生物群落的豐度及多樣性。Shannon和Simpson指數表示菌群多樣性；Chao1和ACE指數表示菌群豐度；覆蓋率表示樣本的測序深度。由表2可知，所有樣本覆蓋率在99.1%～99.3%之間，表明測序深度足以檢測糞便樣本中的微生物群落信息。Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數在11月時蒙古牛樣品中高于其他時間點，次年1月時數值最小，表明11月時蒙古牛樣品中微生物群落的豐度及多樣性相對較高，隨著天氣變冷蒙古牛糞便中微生物群落豐度及多樣性隨著減少。

表3 不同時間點放牧蒙古牛腸道菌群α多樣性指數Table 3 Alpha diversity indexes of intestinal flora of grazing Mongolian cattle among different time points

2.3 不同時間點放牧蒙古牛腸道微生物β多樣性分析

基于加權的UniFrac距離進行了PCoA分析，并構建了系統發育UPGMA聚類樹,分析樣品間微生物的相似性。由圖2可知，主成分PC1和PC2的貢獻率分別為總變量的41.89%和16.55%，11和12月時的放牧蒙古牛樣本相互聚集在一起，而次年1月時的蒙古牛樣本則離散的較遠，單獨聚為一簇，說明寒冷的次年1月時的樣本微生物群落組成與其他時間點差異性較大?；诩訖嗟腢niFrac距離計算后構建的系統發育樹UPGMA聚類樹得出了與PCoA分析相似的結論(圖3)，次年1月的樣本與11和12月能夠明顯的區分開，11和12月的樣品聚為一類，說明這兩個時間點菌群組成有一定相似性。而與次年1月時具有差異性，這可能是由于次年1月時天氣最為寒冷，牧草營養價值低，從而導致與其他時間點的蒙古牛樣本的細菌多樣性產生差異。

PC1值為41.89%，則表示x軸的差異可以解釋全面分析結果的41.89%；PC2值為16.55%，則表示y軸的差異可以解釋全面分析結果的16.55%；圖中的每個點表示一個樣品，同一組的樣品用同一種顏色表示。The PC1 value is 41.89%,which means that the x-axis difference can explain 41.89% of the comprehensive analysis results;The PC2 value is 16.55%,which means that the difference on the y-axis can explain 16.55% of the comprehensive analysis results;Each point in the diagram represents a sample,and the samples of the same group are shown in the same color.圖2 不同時間點放牧蒙古牛樣本主坐標PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of the grazing Mongolian cattle among different time points

2.4 不同時間點蒙古牛腸道菌群門分類水平下的結構

通過物種注釋后，在門分類水平上，選擇了豐度排名前10的物種。由表4可知，不同時間點蒙古牛腸道中占據主導地位的菌群主要包括厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，11、12月和次年1月厚壁菌門的豐度分別為61.83%、57.66%、54.84%；擬桿菌門的豐度分別為32.33%、32.55%和37.87%。其次分別為放線菌門(Actinobacteria)(0.38%、1.10%和0.70%)、變形菌門(Proteobacteria)(1.29%、3.51%和0.57%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.22%、2.70%和3.27%)、廣古菌門(Euryarchaeota)(0.73%、0.15%和1.70%)、藍藻菌門(Cyanobacteria)(0.13%、0.16%和0.01%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)(0.16%、0.30%和0.01%)和酸桿菌門(Acidobacteria)(0.02%、0.07%和0.00%)。不同時間點間放牧蒙古牛腸道微生物群落組成具有差異，隨著天氣逐漸變冷，厚壁菌門豐度減少，而擬桿菌門豐度增多。天氣最冷的次年1月時放牧蒙古牛腸道中藍藻菌門、纖維桿菌門及酸桿菌門幾乎沒有被發現。

左側是UPGMA聚類樹結構，右側的是各樣本在門水平上的物種相對豐度分布圖。UPGMA cluster tree structure is on the left,and the relative abundance distribution of each sample at the phylum level is on the right.Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Actinobacteria:放線菌門；Proteobacteria:變形菌門；Verrucomicrobia:疣微菌門；Euryarchaeota:廣古菌門；Cyanobacteria:藍藻菌門；Fibrobacteres:纖維桿菌門；Acidobacteria:酸桿菌門；Melainabacteria;Others:其他圖3 不同時間點放牧蒙古牛腸道微生物結構的基于加權Unifrac距離的UPGMA聚類樹Fig.3 Based on weighted Unifrac distance of UPGMA cluster tree of gut microbial structure of grazing Mongolian cattle among different time points

表4 門水平上蒙古牛糞便菌群豐度Table 4 Abundance of fecal microbiota for Mongolian cattle at phylum level %

2.5 不同時間點蒙古牛腸道菌群種分類水平下的結構

在屬水平上，由于屬的種類多且部分屬的相對豐度較低，因而僅對排名前10的屬進行了分析。由表5可知，不同組間放牧蒙古牛腸道菌群在屬水平上的優勢物種為擬桿菌屬(Bacteroides)、艾克曼菌屬(Akkermansia)，其11、12月和次年1月擬桿菌屬的豐度分別為5.84%、8.06%、6.32%；艾克曼菌屬的豐度分別為1.22%、2.69%、3.26%。其次分別為未明確棒狀桿菌科相關菌屬(Unidentified_Corynebacteriaceae)(0.00%、0.61%和0.00%)、Romboutsia(2.27%、0.45%和4.29%)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)(0.52%、0.05%和1.54%)、別樣桿菌屬(Alistipes)(3.07%、3.69%和1.78%)、未明確梭菌目相關菌屬(Unidentified_Clostridiales)(0.60%、0.88%和0.59%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)(0.00%、0.17%和0.00%)、未明確藍藻菌相關菌屬(Unidentified_Cyanobacteria) (0.13%、0.16%和0.01%)、未明確瘤胃球菌科相關菌屬(Unidentified_Ruminococcaceae)(1.72%、1.01%和0.98%)。寒冷的次年1月時蒙古牛腸道中艾克曼菌屬、Romboutsia和甲烷短桿菌屬的相對豐度高于其他時間點。

表5 屬水平上蒙古牛糞便菌群豐度Table 5 Abundance of fecal microbiota for Mongolian cattle at genus level %

2.6 不同時間點蒙古牛腸道菌群物種LEfSe分析

組間物種差異分析能夠判別出不同時間點的整體群落結構是否有顯著性的不同。為了找出不同時間點具有顯著差異的物種，可通過LEfSe分析尋找標記性質的物種(Biomarker)。LDA柱形圖長度越長代表差異物種對組間差異性的影響越大。本研究利用LEfSe分析不同時間點的差異物種并通過線性判別分析評估差異物種的影響大小，最后繪制差異物種的線性判別分析值分布柱狀圖，可以清楚的展示出不同時間點各自的優勢物種。線性判別分析值>4的標記性質的物種共有14個。次年1月時最多，有6個重要的微生物類群，包括理研菌科(Rikenellaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和Romboustia屬，其中理研菌科的影響最大。而12月時最少，只有3個標記性質的物種,變形菌門、擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroides)(圖4)。

2.7 PICRUSt功能預測

PICRUSt可以根據16S rRNA 測序數據對樣品中的微生物功能類別相對豐度進行基于KEGG數據庫的功能預測。用PICRUSt對冬季放牧蒙古牛腸道微生物進行了功能預測。由圖5可以看出，KEGG通路二級功能層面上豐度排名前35的預測功能基因及它們在每個組中的豐度信息。寒冷的1月時有18個功能基因通路的豐度增加，有15個功能基因豐度降低。豐度增加的通路包括糖的生物合成和代謝、運輸和分解代謝、信號分子和相互作用、核苷酸代謝、次生代謝產物的生物合成、新陳代謝、碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝、能量代謝和氨基酸代謝等相關通路。然而，豐度增加的這些功能基因通路在11和12月時豐度降低。豐度降低的功能基因通路有免疫系統、細胞運動性、環境適應性、轉錄、復制和修復、膜轉運、細胞生長與凋亡、信號轉導、內分泌系統、神經系統、癌癥、遺傳信息處理、細胞過程和信號和脂代謝通路。結果表明，隨著天氣逐漸變冷，免疫系統、環境適應性及細胞運動性相關通路豐度降低，氨基酸代謝通路豐度增加。

3 討 論

隨著國內外研究者對腸道微生物學研究的不斷深入，諸多研究表明腸道微生物在營養預處理和能量獲取方面發揮著至關重要的作用[24-25]。蒙古牛常年自然放牧，生理生態受外界影響甚少，其腸道微生物群落和組成保持原始狀態。作為草食性反芻動物,其胃腸道需要對牧草中的纖維、淀粉和糖進行吸收利用,而反芻動物胃腸道本身并不能產生必需的纖維降解酶,這種酶必須由與宿主共生的腸道細菌產生,因此研究食物短缺的冬季放牧蒙古牛腸道微生物多樣性具有重要意義。然而關于放牧蒙古牛腸道微生物受季節變化影響的研究尚未報道。

LDA值分布柱狀圖評判細菌分類在不同時間點的顯著差異；縱坐標為不同時間點間具有顯著差異的分類單元；橫坐標為對應分類單元的LDA差異分析對數得分值；柱狀的長度代表LDA得分。The histogram of LDA value distribution is used to evaluate the significant difference of bacterial classification at different time points.The ordinate is the taxon with significant difference among different time points.The abscissa is the logarithmic score value of LDA difference analysis of corresponding taxon.f_Ruminococcaceae:瘤胃球菌科;c_Clostridia:梭菌綱；o_Clostridiales：梭菌目；p_Firmicutes:厚壁菌門；f_Christensenellaceae:克里滕森氏菌科；f_Rikenellaceae:理研菌科；f_Peptostreptococcaceae:消化鏈球菌科；o_Bacteroidetes:擬桿菌目；p_Bacteroidetes:擬桿菌門；c_Bacteroidia:擬桿菌綱；g_Romboustia:Rombostia屬；p_Proteobacteria:變形菌門；f_Bacteroidaceae:擬桿菌科；g_Bacteroides:擬桿菌屬。圖4 不同時間點放牧蒙古牛糞便微生物群落LEfSe多級物種差異LDA判別分析Fig.4 LDA discriminant analysis of LEFSe multi-level species diversity of fecal microbial community in grazing Mongolian cattle among different time points

越偏紅表示相對豐度越高；越偏藍色表示相對豐度越低。More red indicates higher relative abundance;while more blue indicates lower relative abundance.圖5 PICRUSt基因預測聚類熱圖Fig.5 Heatmap of PICRUSt gene predicted function

周應敏等[26]利用高通量測序技術研究亞成體大熊貓腸道菌群多樣性的季節性差異發現，冬季大熊貓腸道微生物結構比較復雜，微生物豐度也相對較高，冬季細菌的優勢度明顯高于其他季節。Oakley等[27]利用16S rRNA基因擴增子測序對肉雞盲腸菌群進行了鑒定發現冬季肉雞盲腸細菌屬明顯少于春季或夏季。Liu等[28]研究發現在相同的飼養條件和生活環境下，冬季組與夏季組相比，同一品系大鼠空腸和回腸厚壁菌門的相對豐度顯著降低，而空腸、回腸和結腸的變形桿菌門的相對豐度顯著增加。這些研究表明季節的變化影響宿主腸道微生物的組成和結構。在本研究中，11和12月時放牧蒙古牛腸道菌群多樣性相似，而與次年1月時相比差異明顯。

食物資源對動物的生存和繁殖至關重要，動物面臨食物資源的可利用率和季節性變化以及寒冷冬季帶來的食物短缺和能量消耗增加的壓力[29]。處于季節性動態變化環境中的動物，其食物的質量也會隨之而變化，動物需要調節自身適應這種食物資源變化帶來的挑戰。因此，了解放牧蒙古牛冬季如何解決這些生存挑戰，更有利于加深對物種的適應性進化的理解。假設季節性的食物變化可以改變蒙古牛腸道微生物多樣性。通過α多樣性分析發現，11月到次年1月，蒙古牛腸道微生物豐富度及多樣性均呈明顯下降的趨勢，且具有統計學意義(Shannon)。從PCoA和UPGMA分析來看，次年1月與其他月份的菌群種類明顯分開，而11和12月的菌群種類相似。淡瑞芳等[16]研究放牧地冬春季、夏季和秋季各牧場的牧草營養成分發現混合草樣營養成分隨季節變化而變化。張盼盼[30]研究表明，牧草中營養成分隨季節變化而變化，冬季牧草的營養價值最低，這與本研究結果相似。由于次年1月份時錫林郭勒盟屬于最寒冷的氣候，牧草營養成分及產量逐漸降低。這說明季節性食物的變化會影響宿主腸道微生物多樣性。

在本研究中，觀察到季節變化與腸道微生物的分類學組成有顯著關系。在門分類學水平上，冬季放牧蒙古牛腸道中厚壁菌門和擬桿菌門占主導地位，這與諸多草食性反芻動物的研究結果一致，如綿羊[31]、駱駝[32]和奶牛[33-34]等。厚壁菌門和擬桿菌門在許多哺乳動物的腸道微生物群落中廣泛分布，表明它們在消化道中的生態和功能意義[35-36]。胃腸道促進纖維分解的主要細菌是厚壁菌門，它能夠將纖維降解為反芻動物可利用的短鏈脂肪酸共宿主使用，而擬桿菌門主要降解碳水化合物，促進胃腸道免疫系統的發育[37]。在本研究中，隨著天氣變冷，牧草質量降低，食物短缺，蒙古牛處于瘦弱狀態，放牧蒙古牛腸道中厚壁菌門豐度減少，而擬桿菌門豐度增多。這與Ley等[38]研究的比較肥胖者和瘦者的腸道微生物組成相似，與瘦者個體相比較，肥胖者腸道中擬桿菌門的相對豐度有所減少，而厚壁菌門增多?，F有的文獻表明，腸道中變形菌門是鑒定哺乳動物腸道健康的關鍵標志，與腸道健康狀態成反比，其數量越少越健康[39]。次年1月時蒙古牛腸道中變形菌門含量最低。說明即使寒冷的季節，蒙古牛腸道微生態系統處于健康狀態。

在蒙古牛的腸道中發現了新抗癌明星細菌屬—艾克曼菌屬。有研究表明，該細菌通過競爭作用保護腸道免受病原體的侵害[40]。若腸道內該細菌的豐度越多，動物就不會有肥胖和炎癥性疾病。除了抑制肥胖之外，還可以促進腸道屏障功能。即使在腸道中沒有營養物質，它也可以蓬勃的繁衍生息，發揮著益生菌的作用[41]。在本研究中，隨著天氣逐漸變冷，蒙古牛腸道中艾克曼菌屬豐度增加，說明蒙古牛腸道微生態系統越健康。最近的研究發現，Romboutsia是一種新發現的細菌屬[42]，通常在人體腸道中被鑒定，在維持宿主健康中扮演著重要的角色[43]。在本研究中，該菌屬在1月時最多。表明在食物短缺的季節，蒙古牛腸道中具有保護腸道且與健康狀況有關的細菌，有利于維持其腸道生態平衡。

腸道中微生物對免疫功能、營養物質的吸收、甚至酶的代謝作用等有一定的影響[44]。腸道微生物對機體的生理功能有一定的影響。PICRUSt軟件預測微生物16S rRNA文庫，對其功能基因和類群進行了探索，進而將菌群結構與宿主代謝相聯系。研究表明，PICRUSt軟件對腸道菌群功能基因預測的準確度為85%～90%[45]。通過與數據庫比對搜索，腸道細菌編碼的大多數基因與代謝相關。PICRUSt功能預測結果表明，寒冷的次年1月碳水化合物代謝、能量代謝和氨基酸代謝等18個功能基因通路的豐度增加；免疫系統、細胞運動性和脂代謝通路等15個功能基因豐度降低。說明放牧蒙古牛腸微生物與分子、糖的生成和代謝等基礎生命功能有關。PICRUSt基因預測聚類熱圖顯示，相同功能在各月份間熱圖顏色有變化，說明各月份樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個月份的樣品中所含微生物的種類和數量有區別，所以各月份的效能存在差異。

4 結 論

利用基于腸道微生物16S rRNA基因測序技術，探索了自然放牧條件下冬季放牧蒙古牛腸道微生物的組成和結構變化。本研究發現，隨著天氣變冷，蒙古牛腸道微生物多樣性和豐度均下降，群落組成與結構也有相應的變化，可體現出微生物在不同時間點所表現出的消化與吸收功能的差異性。季節性食物的變化會影響宿主腸道微生物多樣性。強調了腸道微生物在放牧蒙古牛營養生態學中的重要作用，為了解蒙古牛腸道微生物群的季節動態關系提供了重要的基礎數據。