雌激素通過組胺H1受體調節內臟敏感性的機制研究

秦 斌,許紹嫻,蔣瀟灑,謝丹紅,許曉毓,戴 菲,董 蕾

(西安交通大學第二附屬醫院消化內科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:dong556@126.com)

腸易激綜合征廣泛影響著人類生活質量,特別是給女性的工作和生活狀態帶來困擾,其重要的病理生理機制之一為內臟高敏感。近年有很多關于雌激素和腸易激綜合征(IBS)相關性的研究發現,雌激素可能影響內臟敏感性。以往的研究多有關其經典受體ERα和ERβ介導的雌激素效應[1],近年也有雌激素通過G蛋白偶聯受體調節內臟感知的研究報道,這些研究多集中在雌激素通過中樞層面調節內臟敏感性[2]。然而,腸道是IBS發病和內臟敏感性出現重要的一環,雌激素對腸黏膜功能的直接作用很少被研究。因為雌激素受體在消化道的分布研究較少,雌激素、腸黏膜靶點與內臟敏感性三者的聯系尚不清楚。我們前期研究證實,多種雌激素受體在人類腸道黏膜肥大細胞中表達,并發現雌激素受體之一GPR30的表達與內臟高敏感相關癥狀有關,并進一步通過動物實驗證實雌激素受體同樣表達于大鼠腸道肥大細胞[3]。肥大細胞通常釋放組胺、P物質等活性產物從而發揮活性作用,其中組胺H1R是組胺參與免疫和過敏反應最主要的結合位點,并且有多項研究發現H1R參與IBS發病過程[4],但雌激素是否通過腸道H1R發揮作用尚無研究。本研究在前期研究的基礎上,通過去卵巢大鼠動物模型,探討外源性雌激素引起內臟肌電活動(VMR)改變是否與組胺有關,并進一步探討雌激素通過H1R調節內臟敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

β-雌二醇(Sigma-Aldrich,美國),DMSO(Sigma-Aldrich,美國)。Fexofenadine(Sigma-Aldrich,美國),組胺ELISA試劑盒(上海西唐,中國),大鼠H1R抗體(Santa Cruz,美國)。Power lab記錄分析儀(ADI公司,澳大利亞),生物電放大器(成都生物儀器廠,中國),凝膠成像分析系統與Western顯像系統(Bio-Rad公司,美國)。8F導尿管(B. Braun醫療公司,馬來西亞)。

1.2 實驗動物與分組

雌性SD大鼠,清潔級,體質量200-250 g,8周齡,購自西安交通大學醫學動物實驗中心(許可證號:SYXK(陜)2018-001)。實驗動物給予自來水和普通動物飼料喂養。所有動物均行雙側卵巢切除術,術后7-10 d實驗動物分為4組(n=6):對照組給予對照劑(0.1 ml橄欖油+0.1 ml DMSO腹腔注射)后不采用束縛應激;其余三組均在用藥后0.5 h給予束縛應激,分別為:給予對照劑(0.1 ml橄欖油+0.1 ml DMSO腹腔注射);雌二醇組:給予雌二醇(10 μg/kg,溶于0.1 ml橄欖油腹腔注射+0.1 ml DMSO腹腔注射);雌二醇+組胺H1R阻斷劑組,腹腔注射雌二醇(10 μg/kg,溶于0.1 ml橄欖油)+H1R阻斷劑Fexofenadine(20 mg/kg,溶于DMSO)。

1.3 雙側卵巢切除術和導絲埋置

8%異戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g體質量)腹腔注射麻醉大鼠,俯臥位固定四肢在板上,背部和頸部備皮后用碘酒充分消毒;腰椎水平沿背部正中線兩側2-3 cm縱行切開后逐層分離。暴露出粉紅色豌豆大小的卵巢,用鑷子將脂肪組織和卵巢拉出;分別結扎兩側輸卵管和血管,將卵巢摘除。醫用導線(AF-250A)剪成15-20 cm長度,腹橫肌周圍備皮消毒,行一側腹部皮膚切口后暴露腹外斜肌;用小圓針將3根(1根備用)電極緊密縫在肌纖維上,電極之間距離0.5 cm;將1根長塑料導管(10 cm)沿腹部及背側皮下組織引至頸后外側皮下,在頸外側皮膚消毒切開后引出。檢查無出血后分別縫合腹部和頸部切口。手術后大鼠均單獨飼養,自由進食,恢復7-10 d后用于實驗。

1.4 急性束縛應激后內臟肌電(VMR)檢測

根據實驗分組給藥后30 min行束縛應激,用膠帶將大鼠前肩、雙前肢及胸部綁縛到背部,限制大鼠上肢的活動,但不限制大鼠身體的活動和呼吸;將大鼠單獨放置到籠中,束縛時間為2 h。束縛應激后解除膠帶,30 min后將大鼠放置到筒狀大鼠固定器內使大鼠不能活動、轉身或逃跑;Powerlab電生理記錄儀系統與大鼠頸部裸露電極相連,將帶有球囊的導尿管(8F)插入大鼠距肛門3.5-4 cm處直腸。待大鼠適應固定和球囊擴張(CRD)后,階梯向球囊內注氣,體積分別為0,0.4,0.8,1.2 ml;提高壓力時需排空氣體并間隔3 min。每個壓力梯度持續擴張20 s,重復3次記錄VMR;大鼠VMR使用Chart5.0軟件進行測量計算,VMR的分析采用擴張過程中20 s的曲線下面積(AUC)減去擴張前基線期20 s的面積。將對照組大鼠0.4 ml擴張時AUC設為參照AUC,VMR求相對值。

1.5 標本采集和組胺檢測

各組大鼠球囊擴張結束后,腹腔內注射過量10%水合氯醛處死動物,打開腹腔,用注射器取右心室血,4 ℃下1 500 r/min離心10 min,取上清,-70 ℃保存,用于檢測血漿組胺含量。其后分離截取大鼠遠端結腸,用生理鹽水沖洗后-70 ℃冰箱保存,用于檢測組織中組胺含量和Western blot檢測。一塊大鼠遠端結腸組織用冰生理鹽水反復沖洗剪碎,使用微量電動組織勻漿器將組織塊快速研磨制成10%的組織勻漿。血漿和組織中組胺含量測定參照ELISA試劑盒說明書和既往研究分別進行[5]。

1.6 Western blot法檢測腸道H1R受體

參照既往的方法[6],簡要步驟如下:取實驗大鼠腸道標本一塊剪碎加入裂解液,倒出組織勻漿液置于EP管中高速離心5 min提取蛋白。準備BCA工作液稀釋BSA標準品,酶標儀計算待測樣品的蛋白含量。DS-PAGE凝膠電泳:取出蛋白樣本,冰上溶解,提取計算好的蛋白樣品與緩沖液在室溫下按照1 ∶5體積比均勻混合,95 ℃煮沸5 min。制膠和灌膠后進行蛋白質的轉移至PVDF膜上。將PVDF膜放入到5%牛奶封閉后加入H1R一抗，搖床上4 ℃過夜，加入二抗室溫2 h，浸入增強化學發光試劑中顯色。按30 s、1 min、3 min、5 min梯度曝光，用掃描儀對顯影結果進行掃描，用Gel-Pro軟件分析目的蛋白與內參的灰度比值，作為H1R蛋白表達的相對水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 急性束縛應激對去卵巢大鼠VMR的影響

大鼠在直腸擴張體積為0 ml時,VMR表現為平滑的曲線,當球囊擴張體積為0.4 ml時,肌電圖變得密集,當球囊擴張體積為0.8 ml和1.2 ml時,肌電圖波形變得更加密集,并出現明顯增高和成簇出現的波峰(見圖1)。對不同球囊擴張體積下兩組大鼠腹壁肌電活動(VMR)統計分析發現,在0 ml和0.4 ml球囊直腸擴張時兩組大鼠腹壁肌電圖曲線下面積無統計學差異,在球囊擴張體積為0.8 ml和1.2 ml時,應激組大鼠VMR明顯高于對照組(P<0.01,見圖1)。

與control組相比,*P<0.01,**P<0.01圖1 應激組與對照組球囊擴張后VMR的比較Figure 1 Comparison of VMR after CRD between stress group and control group

2.2 外源性雌激素對VMR的影響

與應激組相比,雌激素組大鼠在0.4 ml直腸球囊擴張時VMR無明顯差異,而在0.8 ml(P=0.036)和1.2 ml(P=0.017)球囊擴張時VMR明顯升高(見圖2)。

2.3 阻斷H1R對外源性雌激素調節VMR的影響

給予去卵巢大鼠H1R阻斷劑Fexofenadine(Fex)和雌二醇(estradiol)后檢測動物腹壁肌電活動,發現:兩組大鼠在0.0 ml和0.4 ml體積直腸球囊擴張時VMR無明顯差異,而estradiol+Fex組在0.8 ml和1.2 ml體積球囊擴張時VMR明顯低于estradiol組(P<0.01,見圖2)。當球囊擴張體積為0.8 ml和1.2 ml時,VMR波形逐漸密集,在1.2 ml時出現增高和成簇出現的波峰(見圖2)。

圖2 不同組別直腸球囊擴張后VMR的比較Figure 2 Comparison of VMR after CRD between different groups

2.4 血漿和腸道組胺的變化

四組大鼠血漿組胺濃度相比無差異(P=0.53,見表1)。與control相比,stress組腸道組胺含量升高(P=0.04),estradiol+stress組腸道組胺含量明顯高于control組和stress組(P<0.01),H1R阻斷劑Fex組腸道組胺含量明顯高于control組和stress組(P<0.01),而estradiol+stress組和estradiol+Fex+stress組之間無統計學差異(P=0.34,見表1)。

表1 不同組別血漿和腸道組胺含量的比較

2.5 腸道H1R蛋白的表達

通過Wesern blot法檢測H1R在腸道的表達發現:estradiol+stress組和estradiol+Fex+stress組、control組、stress組大鼠腸道H1R的相對蛋白含量(H1R/GADPH)無明顯統計學差異(P=0.93,見圖3)。

圖3 不同組別腸道H1R的含量比較Figure 3 Comparison of H1R content in colon among different groups

3 討論

前期的研究發現,在腸道可以檢測出雌激素多種受體,并且與內臟敏感性相關[3],但是否通過組胺等活性物質發揮作用尚不明確。本實驗證實了雌激素引起VMR升高的同時腸道組胺也出現了升高,而阻斷組胺H1R時可以逆轉雌激素對VMR的作用。

大鼠腹壁電生理檢測即VMR能直接記錄腹壁肌電活動,從而反映大鼠的內臟敏感性,為大鼠內臟痛檢測提供了客觀和可量化的指標,是目前腸道電生理研究中通用的反映內臟敏感性的方法[7]。在本實驗中VMR隨擴張球囊壓力升高而增高,檢測結果具有可重復性,說明VMR間接地提示了動物模型內臟敏感狀態。研究通過結直腸球囊擴張后記錄VMR,發現急性束縛應激大鼠內臟敏感性高于未接受應激者,說明急性束縛應激模型可以誘發內臟高敏感狀態,因此本研究采用急性束縛應激聯合直腸球囊擴張的方法檢測大鼠VMR作為動物模型。大鼠的雌激素水平因性別而異,雄性大鼠的雌激素來源于體內多個器官,影響因素較多難以控制其含量,因此本實驗未使用雄性大鼠。而雌性大鼠的雌激素主要來源于卵巢,但其水平隨著動情周期波動,因此本研究中使用雌性大鼠,在雙側卵巢切除后給予外源性雌激素,使實驗動物間雌二醇水平具有可比性。

去卵巢雌性大鼠在急性束縛應激前給予外源性雌激素能明顯增加大鼠內臟敏感性,直接說明雌激素能影響內臟感知,這與以往的研究結果一致[8]。但以往的研究多發現雌激素在中樞層面的作用[9,10],而雌激素促使外周腸道釋放活性物質少有研究,本研究通過檢測腸道活性物質的改變探討雌激素對腸道靶點的直接作用。組胺是人和動物體內重要的化學遞質,多數貯存于肥大細胞中,當機體受到某種刺激引起肥大細胞膜通透性增加便會釋放組胺等活性物質。因此本研究選擇腸道組胺水平來反映肥大細胞脫顆粒的狀態。但組胺存在于消化道、呼吸道、皮膚等多個部位,因此研究中同時檢測了血漿組胺水平,以免腸道外來源的組胺影響結論的推斷。研究中檢測到雌二醇干預后VMR的增高伴隨著腸道組胺含量的增加,而血漿組胺水平并無改變,提示腸道可能是雌激素調節內臟感覺的靶點之一,且雌二醇的作用與腸道組胺等活性物質的改變有關,而大鼠血漿組胺無明顯改變提示雌激素作用的靶點可能為腸道肥大細胞而非中樞位點。腸道存在多種活性物質,包括五羥色胺、P物質、血管活性腸肽等,本研究僅證實了腸道組胺水平的變化,并未排除其他活性物質潛在的作用,不能除外多種活性物質協同作用調節內臟敏感性。

組胺影響腸道功能的作用不但與組胺的含量有關,還可能與組胺受體的水平和活性相關,而組胺受體亞型有四種,其中組胺1型受體H1R是其參與免疫和超敏反應最主要的結合位點[11],既往研究發現H1R參與IBS內臟高敏感發病過程[4,12]。通過使用組胺H1R阻斷劑Fexofenadine(Fex)阻斷組胺H1信號,證實Fex聯合雌激素降低了雌激素對內臟敏感性的影響。研究還發現Fex對大鼠血漿和結腸的組胺水平均無影響,說明H1R阻斷劑起作用依賴的是阻斷H1信號,而不是影響組胺的釋放,同時進一步說明組胺是雌激素調節內臟感知的中間介質之一。研究還檢測了實驗動物腸道H1R的含量,發現在4個不同的組別中,雖然各組大鼠內臟敏感性不同,但H1R的含量無統計學差異,提示影響內臟敏感性高低的是腸道組胺的含量,而不是H1R的含量水平。本研究的另一局限性在于僅研究了組胺受體一種亞型的作用,無法完全排除組胺其他亞型的影響。并且雖然證實了組胺通過腸道受體H1R調節內臟敏感性,但因為動物模型中未阻斷中樞神經系統下傳的通路,因此不能完全排除中樞層面的影響。

綜上所述,本研究證實雌激素調節大鼠內臟敏感性的作用與腸道組胺的含量有關,外源性雌激素可以增加腸道組胺含量而增加內臟敏感性,在H1R阻斷劑抑制組胺的作用后,雌激素對內臟敏感性的增強效應減低,而具體的信號通路尚需進一步通過細胞實驗研究闡明。