生防菌使用方式對煙草青枯病的防效及根際土壤細菌群落的影響

黎妍妍，李春黎，王林，彭五星，楊勇，陳守文，李錫宏

1 湖北省煙草科學研究院，武漢 430030；

2 湖北大學 生命科學學院，武漢 430070；

3 湖北中煙工業有限責任公司，武漢 430040；

4 恩施州煙草公司 宣恩縣煙葉分公司，恩施 445500

煙草青枯病由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細菌性土傳病害，每年給煙葉生產造成巨大損失[1]。經過近年來綠色防控重大專項的實施，煙草青枯病的防治主要以生物防治為主。生物防治不僅對植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生產中存在的農藥殘留和病菌抗藥性等問題[2-3]。利用生防菌是植物病害生物防治的重要手段。目前，生防菌多采用菌液兌水灌根的方式施用[4-5]。然而，由于土壤微生態環境的復雜性[6]，生防菌進入土壤后，土壤微生物對這種外來“入侵者”會產生強烈的排斥作用。由于環境不適、營養不足等原因，施用的生防菌往往無法定殖，從而不能很好地發揮其生防功能，致使其抑菌功能和控病作用難以顯現。因此，根據土壤微生態原理的營養抗性理論，應在生防菌的使用等方面加以改進[7]。本研究旨在通過田間小區試驗和擴增子測序技術，探究生防菌劑不同使用方式對煙草青枯病的防控效果及其對煙株根際土壤細菌群落的影響，以期為進一步提升生防菌的防控效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌株（YH-22）[5]為芽孢桿菌，按相關工藝將其發醇、干燥成粉劑（1.0×1010CFU/g）；米糠為市場購入。

1.2 試驗地點及試驗設置

2018年在湖北省恩施州宣恩縣（29.97°N，109.38°E）開展該試驗。試驗地連作15年，青枯病發生嚴重。試驗設置5個處理，GG為生防菌兌水灌根，生防菌：水按1∶500混勻后灌根50 mL/株；WG為生防菌拌土圍根，生防菌：土按1: 1000混勻后圍根100 g/株；MK+WG為米糠+生防菌拌土圍根，米糠: 生防菌: 土為60∶1∶940，先將米糠和生防菌混合均勻，噴水后覆膜、發醇20～25 d，然后拌土圍根100 g/株；CK1為清水灌根50 mL/株；CK2（MK）為米糠拌土圍根，米糠：土按3∶47混勻后圍根100 g/株。隨機區組排列，3次重復，每小區種植烤煙60株，株行距為0.55 m×1.2 m，煙草品種為云煙87。煙葉移栽時和移栽后40 d各處理各施用一次，每次劑量相同。

1.3 煙草青枯病發生情況調查

1.4 煙株根際土壤樣品采集

煙葉移栽后100 d 時，選取每小區長勢較為一致的5 株煙株，采集根際土壤（與根系結合較緊密的4 mm 內的土壤）樣品。每小區5 株煙株根際土樣混合形成一個樣品，共采集15個土樣。將土樣置于干冰（固態CO2）中帶回實驗室，放置于-80℃冰箱中保存，以備提取DNA。

1.5 土壤微生物群落分析

1.5.1 DNA 提取及PCR 擴增

采 用FastDNA Spin Kit 試 劑 盒（MP Biomedicals, USA） 提 取 土 壤 總DNA。 以515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物對細菌16S rDNA V4 可變區進行PCR 擴增。30 μL 擴增體系包括：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL 引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL ddH2O。反應程序包括：98℃ 1 min；98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s（30 個循環）；72℃ 5 min（Bio-rad T100 梯度PCR 儀）。PCR 產物檢測合格后進行文庫構建，使用Illumina Hiseq PE250測序平臺進行測序（由諾禾致源生物信息科技有限公司完成）。

1.5.2 OTU 聚類與物種注釋

以97%的一致性將所有樣品的有效序列聚類為OTUs。對OTUs 代表序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析。

1.6 數據處理

利用R軟件（V 2.15.3）繪制稀釋曲線圖。利用Qiime 軟件（V 1.9.1）計算Sobs、Chao1豐富度指數和Shannon多樣性指數。在門分類水平上，基于加權Unifrac距離，利用Qiime軟件（V 1.7.0）對土壤細菌群落組成進行UPGMA聚類分析。用SPSS 22.0中的One-way ANOVA分析煙草青枯病病情指數和細菌群落組成等在各處理間的差異（P＜0.05水平）。根據屬水平上的物種注釋和豐度信息，對各樣品的物種豐度進行標準化處理，得到Z值，采用HemI軟件（V1.0）繪制Heatmap圖。Z=（a-Av）/SD，其中a為樣品在該分類上的相對豐度，Av為所有樣品在該分類的平均相對豐度，SD為所有樣品在該分類上的標準差。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病發生情況

煙葉移栽后100 d 對煙草青枯病發生情況進行了調查與分析。結果表明，GG、WG 和MK+WG處理煙草青枯病病情指數均顯著低于CK1，WG 和MK+WG 處理煙草青枯病病情指數均顯著低于CK2。依據病情指數，計算得GG、WG、MK+WG 和CK2相對于CK1 的防效分別為49.72%、55.93%、59.32%和36.72%，表明生防菌不同施用方式對煙草青枯病的防效表現為MK+WG＞WG＞GG（圖1）。

圖1 煙草青枯病發生情況Fig. 1 The occurrence of tobacco bacterial wilt

2.2 根際土壤測序深度評估

以細菌有效序列數為橫坐標、OTU 數量為縱坐標的土壤細菌群落稀釋曲線表明，在97%一致性的OTUs 分類水平下，測序量增加的初始階段時OTU數量急劇上升；之后，OTU 數量基本趨向于平緩，表明測序數量基本合理，可反映土壤細菌群落絕大多數序列信息（圖2）。

圖2 根際土壤細菌群落OTUs 稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curve of bacterial community in rhizosphere soil OTUs

2.3 土壤細菌群落多樣性和豐富度分析

對根際土壤細菌群落多樣性和豐富度進行了差異分析。土壤細菌群落OTU數量以WG、MK+WG和CK2顯著高于CK1，而與GG間無顯著差異；Sobs和Shannon指數在GG、WG、MK+WG和CK2間無顯著差異，但均顯著高于CK1；Chao1指數以WG、MK+WG顯著高于CK1，而與GG、CK2無顯著差異。其中，OTU數量、Sobs和Shannon指數均以MK+WG處理最高，分別較其它處理高2.72%～54.04%、2.62%～49.01%和1.23%～21.40%；C h a o 1 指數以W G 處理最高，較其它處理高0.53%～40.35%（表1）。

表1 土壤細菌群落多樣性和豐富度分析Tab. 1 The analysis of diversity and richness of soil bacterial community in rhizosphere soil

2.4 門水平上土壤細菌群落組成分析

2.4.1 土壤主要細菌門相對豐度分析

對相對豐度排名前1 0 位的土壤細菌門進行了分析。在各處理根際土壤中，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，占40.26%～50.68%；其它細菌門分別為放線菌門（Actinobacteria，7.70%～21.64%）、酸桿菌門（Acidobacteria，9.69%～16.76%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，4.8 7%～9.6 6%）、厚壁菌門（F i r m i c u t e s，1.87%～13.62%）、綠彎菌門（Chloroflexi，3.57%～6.74%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.04%～5.90%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，0.41%～2.60%）、 疣微菌門（Verrucomicrobia，1.11%～2.07%）和浮霉菌門（Planctomycetes，1.15%～2.00%）。這10個細菌門的相對豐度共占94.64～97.03%（表2）。

表2 土壤細菌群落主要門的相對豐度Tab. 2 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

根際土壤中放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和綠彎菌門的相對豐度在各處理間存在顯著差異。GG中芽單胞菌門的相對豐度顯著高于CK1，增加67.56%；酸桿菌門的相對豐度顯著高于其它處理。WG中放線菌門的相對豐度顯著高于CK1和CK2，分別增加130.78%和99.66%；芽單胞菌門的相對豐度顯著高于CK1，增加98.36%。MK+WG中放線菌門和綠彎菌門的相對豐度均顯著高于CK1和CK2，其中放線菌門分別增加181.04%和143.15%，綠彎菌門分別增加68.50%和88.80%。GG、WG和MK+WG處理中厚壁菌門的相對豐度均顯著低于CK1，而與CK2無顯著差異。

2.4.2 門水平上土壤細菌群落聚類分析

對各處理根際土壤細菌群落在門分類水平上進行了UPGMA聚類分析。各處理間土壤細菌群落門水平的組成及豐度差異較為明顯。WG和MK+WG處理相似性較高，聚為一類；GG和CK2相似性較高，聚為一類；CK1單獨為一類。以上結果表明WG和MK+WG處理對煙株根際土壤細菌群落組成具有較大影響（圖3）。

圖3 土壤細菌在門分類水平上的UPGMA 聚類樹圖Fig. 3 UPGMA clustering tree diagram of soil bacteria at phyla level

2.5 屬水平上土壤細菌群落組成分析

對各處理根際土壤中主要細菌屬的相對豐度進行了分析。GG、WG、MK+WG和CK1、CK2中相對豐度＞1%的細菌屬分別有7、7、7和11、5個（表3）。對各處理土壤樣本中這19個細菌屬的相對豐度相似性繪制了Heatmap圖（圖4），結果表明，WG和MK+WG處理相似性較高，聚為一類；CK1和CK2相似性較高，聚為一類；GG單獨為一類。

圖4 屬水平上土壤細菌豐度聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of relative abundance of soil bacteria at genus level

表3 土壤細菌群落主要屬的相對豐度Tab. 3 The relative abundance of soil bacteria community at major genus levels

對這些細菌屬的相對豐度在各處理間的差異進行了方差分析， 結果顯示，Mizugakiibacter、Sphingomonas、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Roseburia、Massilia、Rhodanobacter、Bryobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對豐度在各處理間存在顯著差異。

與CK1相比，GG處理顯著提高了土壤中Massilia和Gaiella的相對豐度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Roseburia和Rhodanobacter的相對豐度；WG和MK+WG處理顯著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對豐度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Roseburia和Bryobacter的相對豐度；此外，WG處理還顯著降低了Rhodanobacter的相對豐度。與CK2相比，GG處理顯著降低了Sphingomonas的相對豐度；W G 和M K+W G 均顯著提高了Pseudarthrobacter、Ramlibacter和Gaiella的相對豐度，而降低了Sphingomonas和Burkholderia-Paraburkholderia的相對豐度；此外，WG處理還顯著提高了Gemmatimonas的相對豐度，MK+WG處理還顯著提高了Bradyrhizobium的相對豐度。

3 討論

生防菌在防治作物青枯病中的研究與應用已有較多報道。研究表明，生防菌的防效通常受生防菌、病原菌、植株和環境等多方面的影響[8]。這些方面相互作用，造成根際土壤微生物群落結構的改變，進而影響煙草青枯病的發生與流行。因此，分析生防菌的使用對土壤微生物群落的影響，對于探明生防菌防控青枯病的機理，改進并探尋合適的使用方式具有重要意義。

本研究在進行煙草青枯病發病情況調查時發現，無論是與CK1（清水灌根）相比較，還是與CK2（米糠圍根）相比較，生防菌拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根的使用方式均能顯著降低煙草青枯病的病情指數，而這兩者之間并無顯著差異，表明對煙草青枯病起主要防控作用的是生防菌。有研究指出可以通過改進生防菌的使用方法來提升生防菌的拮抗效果[7]，添加一些載體材料可以提高生防菌的定殖能力和有效性[11-12]。本研究中添加的米糠和生防菌發醇可能有助于促進兩者融合，使米糠為生防菌提供空間保護，更有利于生防菌在土壤環境中定殖；同時，米糠中富含的豐富的蛋白質、脂肪、多種維生素和礦物質等，可作為營養介質為生防菌提供持續的營養，從而使生防菌在營養上處于優勢。

一般來說，微生物群落多樣性和豐富度指數越高，其響應各種脅迫的修復能力也越強[9]。與青枯病發病煙田相比，健康煙田煙株根際土壤具有較高的微生物群落多樣性和豐富度[10]。本研究結果顯示，生防菌拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根較生防菌兌水灌根更能明顯提高煙株根際土壤細菌群落的Sobs、Shannon和Chao1等多樣性和豐富度指數，其中尤以米糠+生防菌拌土圍根的提升效果顯著，表明米糠+生防菌拌土圍根更能提高煙株根際土壤細菌群落的修復能力，從而更好地保護煙株免受青枯菌的侵染。

從根際土壤細菌群落組成結果可以看出，具有拮抗作用或促生作用的細菌門的相對豐度在施用生防菌后發生了顯著變化。生防菌兌水灌根和生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中芽單孢菌門、生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中放線菌門的相對豐度，這些細菌可能產生更多的抗生素或其它次生代謝產物來抑制土傳病原菌的定殖，從而有利于植株健康生長[13-15]。

在屬水平上，生防菌兌水灌根顯著提高了土壤中Gaiella的相對豐度，生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對豐度。研究表明，Gaiella屬于放線菌門，其相對豐度的增加可顯著抑制番茄枯萎病等土傳病害[16]。與青枯病發病土壤相比，健康土壤中Gemmatimonas、Bradyrhizobium等細菌屬的相對豐度顯著提高[10]。由此可見，生防菌兌水灌根促使土壤中Gaiella等，生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升，有利于恢復土壤健康。

需要指出的是，盡管在該研究中米糠+生防菌拌土圍根和生防菌拌土圍根在減輕煙草青枯病為害的作用中無顯著差異，但前者在調理根際土壤細菌群落多樣性以及結構中表現出一定的優勢。因此，從長遠角度講，米糠+生防菌拌土圍根可通過改善土壤微生態環境進一步減輕煙草青枯病的為害。

4 結論

本研究探究了生防菌不同使用方式（兌水灌根、拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根）對煙草青枯病的防效及調節土壤細菌群落的作用，為提升生防菌的防控效果提供了理論依據。生防菌不同使用方式對青枯病的防效表現為米糠+生防菌拌土圍根（59.32%）＞生防菌拌土圍根（55.93%）＞生防菌兌水灌根（49.72%）。生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根均可顯著提高煙株根際土壤細菌群落的多樣性和豐富度，以米糠+生防菌拌土圍根效果最為顯著。生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根對煙株根際土壤細菌群落結構具有顯著影響，提高了土壤中放線菌門的相對豐度，促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升。綜合來看，米糠+生防菌拌土圍根更有利于恢復土壤健康、減輕青枯病對煙株的為害。