不同來源精子行ICSI助孕臨床結局分析

孫慶云，曹金鳳，杜元杰，周亮，朱序理，王躍，趙志明

(河北醫科大學第二醫院生殖醫學科，石家莊 050000)

據報道，我國不孕不育夫婦中約20%的不育癥是由單純男方原因引起，27%由男女雙方原因引起，總體男方因素所致不育約占50%[1]。近年來，卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術的成熟應用給許多男性不育患者帶來希望。有學者認為射精、經皮附睪穿刺抽吸術(PESA)、經皮睪丸精子抽吸術(TESA)等方式獲得的精子行ICSI可以獲得相似的臨床妊娠率[2-3]，但其最終妊娠結局的報道不一，且對于其嬰兒出生結局的報道較少。本研究回顧性分析本院生殖醫學中心3種不同來源精子行ICSI助孕的患者資料，旨在探討不同來源精子對ICSI周期活產率、出生缺陷發生情況等助孕結局的影響，以期更好地指導臨床工作。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：回顧性分析2012年1月至2018年6月在本院生殖醫學中心行ICSI-ET助孕的2 527例患者(2 573個新鮮移植周期)的臨床資料。納入標準：(1)女方年齡≤38歲；(2)MⅡ卵數≥3枚；(3)助孕周期≤2個周期；(4)移植胚胎數2枚；(5)促排方案采用黃體中期長方案。排除標準：(1)女方因輸卵管積水、宮腔積液等因素造成的不孕；(2)夫婦一方或雙方染色體核型異常。

根據精子獲取方式不同分為：射精組，1 987 例(2 007個周期)；PESA組，353 例(373個周期)；TESA組，187例(193個周期)。

2.研究方法：控制性促排卵：采用黃體中期長方案促排，自促排前1個月經周期的黃體中期開始，給予促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達必佳，輝凌，瑞士)0.1 mg每日皮下注射，達到降調標準后開始每日注射150～300 U促性腺激素(Gn)直至扳機日，當卵泡發育達到至少有1個主導卵泡直徑≥18 mm或兩個主導卵泡直徑≥17 mm或3個主導卵泡直徑≥16 mm時，于該日21∶00肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，HCG注射后36～38 h經陰道超聲引導下取卵。

取卵日精子準備：(1)射精組：患者禁欲3～5 d后手淫法取精，密度梯度離心法處理精液，極偶見精子的精液可使用直接洗滌法。(2)PESA組：囑患者排空膀胱，取仰臥位，常規消毒鋪孔巾，2%利多卡因精索阻滯麻醉，采用5 ml注射器連接4號針頭吸取1 ml培養液，經皮行附睪穿刺，邊穿刺邊抽吸，在針頭端可見渾濁附睪液體抽出，將附睪液轉移至培養皿中。在倒置顯微鏡下觀察是否有活動精子，如有則直接洗滌法處理附睪液備用；如鏡下未找到活動精子則重復穿刺另一側附睪，如穿刺失敗或仍無活動精子則改行TESA取精術。(3)TESA組：患者排空膀胱后取仰臥位，常規消毒鋪孔巾，2%利多卡因精索阻滯麻醉，采用20 ml注射器連接12號針頭(帶側孔)，經皮行睪丸穿刺，將取到的睪丸組織注入含G-MOPs液(vitrolife，瑞士)的培養皿中，用兩只1 ml注射器針將組織分離撕碎，倒置顯微鏡下觀察是否有精子。有精子者將撕碎的組織混懸液離心，300g離心5 min，留沉渣置36℃培養箱內備用；若鏡檢未找到精子者需要再次穿刺睪丸取精，如再次穿刺睪丸鏡檢仍未找到精子則經患者夫婦知情同意后將卵子冷凍保存。

人工授精：取卵后卵冠丘復合物置于受精液中預培養1～2 h后拆去顆粒細胞，觀察卵母細胞成熟度并對成熟卵母細胞進行ICSI操作。

胚胎移植和黃體支持：胚胎培養3 d后擇優移植，移植胚胎數均為2枚。移植后行常規黃體支持：肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d或8%黃體酮緩釋凝膠(雪諾同，默克，英國)陰道給藥1次/d。B超檢查見心管博動后逐漸減量至停止。

胚胎評估與冷凍：ICSI后16～18 h進行原核觀察，ICSI后40～42 h(D2)和64～66 h(D3)進行卵裂期胚胎觀察。根據胚胎形態特征對D3胚胎進行評分分級，胚胎評分標準按英國Bourn Hall Clinic評分法[4]進行，D3胚胎冷凍標準：移植后剩余的評分1、2級的胚胎進行玻璃化冷凍保存。

臨床妊娠的診斷標準：患者胚胎移植后14～15 d，檢查尿妊娠試驗陽性或血β-HCG≥10 U/L為HCG陽性；胚胎移植后28～30 d 超聲檢查可見孕囊及心管搏動者為臨床妊娠。

觀察指標：記錄3組的臨床妊娠率(臨床妊娠周期數/移植周期數×100%)、胚胎種植率(種植胚胎數/移植胚胎數×100%)、正常受精率(2PN率)(2PN數/MⅡ卵數×100%)、2PN卵裂率(2PN卵裂數/2PN數×100%)、可利用胚胎率(可利用胚胎數/2PN卵裂數×100%)、流產率(流產周期數/妊娠周期數×100%)、活產率(活產周期數/移植周期數×100%)、出生胎兒男女比例以及出生缺陷率(出生缺陷胎兒數/出生胎兒總數×100%)。

二、結果

1.各組患者的一般資料比較：統計結果顯示，不同來源精子組的女方年齡、助孕周期數、不孕年限、獲卵數、MⅡ卵數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者一般資料比較(-±s)

2.各組患者的實驗室指標比較：統計結果顯示，射精組的2PN率和可利用胚胎率顯著高于PESA和TESA組(P<0.01)；射精組、TESA組的2PN卵裂率顯著高于PESA組(P<0.01)(表2)。

表2 三組患者實驗室指標比較(%)

3.各組患者的妊娠結局及新生兒情況比較：3組患者的臨床妊娠率和胚胎種植率比較無顯著性差異(P>0.05)；3組患者的多胎率、流產率、活產率、新生兒男女性別比及出生缺陷發生率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同來源精子患者的妊娠結局(%)

三、討論

隨著輔助生殖技術的發展，ICSI技術在臨床成熟應用，不同來源精子行ICSI均可獲得較好的妊娠結局，但不同來源精子對臨床結局的影響各學者報道不一，仍存在爭議。本研究主要對不同來源精子行ICSI的實驗室數據和臨床結局進行分析，樣本量較大，入組標準更嚴格，女方年齡≤38歲，患者促排方案均為黃體中期長方案，移植胚胎均為D3卵裂期胚胎，移植數均為2枚，各組患者一般資料具有可比性，更能客觀分析不同精子來源對妊娠結局的影響，且隨訪并統計了患者活產率、出生嬰兒性別比及出生嬰兒缺陷率等，為指導臨床工作提供了更全面的參考。

1.不同取精方式對實驗室指標的影響：射精組、PESA組和TESA組的2PN率分別為83.28%、76.75%和76.33%，射精組最高，這可能與射精組精子活力、活率總體高于PESA組和TESA組有關，而附睪、睪丸穿刺獲得的精子量少、活力差、活率低，精子畸形率相對高，盡管行ICSI仍有部分精子不能有效激活卵子受精。有報道稱ICSI受精率與精子活力、活率有關[5]。本研究中射精組、PESA組和TESA組的2PN卵裂率分別為98.84%、97.85%和99.26%，PESA組顯著低于射精組和TESA組；這與之前部分學者的報道不同，可能與經皮附睪穿刺獲得的精子DNA碎片率較高有關，尤其是在阻塞性無精子癥患者中，精子在附睪內停留時間長，精子活動力下降，DNA斷裂增加，從而可以導致胚胎發育阻滯[4，6]。3組的可利用胚胎率分別為57.43%、53.59%和53.28%，PESA組雖然2PN卵裂率顯著低于TESA組，但兩組的可利用胚胎率相似，射精組可利用胚胎率最高，這可能與射精組2PN受精率高從而可以獲得更多的胚胎發育有關[2]。

2.不同取精方式對妊娠結局的影響：不同來源即射精、附睪、睪丸來源精子行ICSI的妊娠結局報道不一，部分學者報道TESA組受精率低、妊娠率低[7-9]，另外有學者則認為PESA組和TESA組種植率和妊娠率較射精組高[10-11]。目前大部分研究集中于不同來源精子行ICSI后的胚胎實驗室指標和早期臨床妊娠結局，包括我們前期開展的研究，由于樣本量小，研究結論認為TESA組著床率、妊娠率有升高的趨勢[2]，但未對不同來源精子行ICSI后活產率進行分析。本研究結果與上述報道有所不同，本研究中射精組、PESA組和TESA組的臨床妊娠率、種植率、多胎率、流產率、活產率比較均無顯著性差異，提示不同來源精子行ICSI后可以獲得相似的活產率[3，12-13]，該結論對臨床有較重要的指導意義，提示在臨床工作中不應單純認為睪丸穿刺取精行ICSI的妊娠率高，在1次體外助孕失敗后直接行睪丸穿刺取精ICSI[14]；如果患者取精方便可以行射精來源ICSI，以避免不必要的睪丸手術和創傷以及遠期對男性激素分泌的可能影響[15-16]。對于反復種植失敗患者或者DNA碎片較高患者可以考慮睪丸穿刺取精行ICSI[17-19]，但應嚴格把握睪丸穿刺適應證。本研究3組患者的多胎率均較高，可能與患者年齡均≤38歲，胚胎質量較好有關。目前我們在臨床工作中，已經實行部分患者D3單胚胎移植或者囊胚培養后行單囊胚移植，以避免多胎妊娠。

3.不同取精方式對嬰兒出生性別比及出生缺陷發生率的影響：關于不同來源精子行ICSI后出生情況的報道較少，PESA、TESA精子與正常射精所得精子在精子形態、活力以及攜帶遺傳物質等方面可能存在差異，但是否導致胚胎發育異常繼而增加子代出生缺陷發生的風險尚不明確。有報道稱在重度少弱精子癥患者中，睪丸和附睪來源精子、睪丸和供精來源精子行ICSI后，其圍產結局及新生兒參數沒有顯著差異[20-21]。Guo等[22]也報道與射精組相比，PESA、TESA組行ICSI并不增加死胎及胎兒畸形的幾率，雖然沒有顯著性差異，但TESA組的胎兒畸形率有輕微上升的趨勢。本研究中射精組、PESA組和TESA組的出生性別比及出生缺陷率比較無顯著性差異，提示不同來源精子行ICSI后并未增加嬰兒性別差異及子代出生缺陷發生風險，不同來源的精子均能獲得較好的妊娠結局。

綜上所述，對于男性不育患者，不同來源精子行ICSI助孕雖然2PN率、2PN卵裂率和可利用胚胎率不同，但最終均能獲得較好的活產率及相似的妊娠結局，且未明顯增加嬰兒出生性別差異及子代出生缺陷；提示如射精可以獲得精子時可以優先考慮射精取精，而非優選附睪或睪丸穿刺取精。