雙光子受激發射損耗復合顯微成像技術研究

魏通達，張運海，昌 劍，季 林，楊皓旻，繆 佳

（1.中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所 醫用光學重點實驗室，江蘇 蘇州 215163；2.江蘇省醫療器械檢驗所蘇州分所，江蘇 蘇州 215163）

引 言

神經系統疾病的精準診斷對臨床診斷工具提出了越來越高的要求，迫切需要一種既可以高分辨成像又可以深層成像的輔助診斷工具。雙光子技術是常用的深層成像技術，最深可達1 mm，但分辨率只有300～500 nm，對于神經細胞中類似樹突棘等亞細胞結構成像仍然存在局限性[1]。受激發射損耗（STED）超分辨成像的分辨率可達50 nm 以下，但只能用于30 μm 以內淺表層成像[2]。因而將雙光子成像和STED 成像結合形成的雙光子STED 復合顯微鏡則既可以實現超高分辨成像，也可以實現深層成像。

德國的Moneron 等[3]于2009 年首次把雙光子熒光顯微技術與STED 顯微技術結合，搭建了第一個雙光子STED 顯微系統，將1 060 nm 的飛秒激光器作為雙光子激發光源，676 nm 的連續激光器作為STED 光源，得到了熒光標記的轉錄調節因子三維分布。2009 年，加拿大的Li 等[4]使用兩束脈沖激光實現了雙光子STED 成像，他們使用兩臺鎖相同步鈦藍寶石飛秒激光器分別用于雙光子激發和受激發射損耗，獲得了分辨率小于 50 nm 的中國倉鼠卵巢細胞圖像。2011 年，法國的Scheul 等[5]僅用一臺脈沖激光器，通過一塊偏振晶體將脈沖光分為雙光子光源和STED光源。2013 年，法國的Bethge 等[6]用雙光子STED顯微鏡實現了對腦切片的雙色成像。2016 年，意大利的Hernandez 等[7]采用了門控探測技術，結合多圖的反卷積算法，提高了系統成像質量。

國內在雙光子STED 成像方面的研究起步較晚，但進展較快。2014 年，天津大學研究組用一臺鈦藍寶石激光器進行了雙光子STED 實驗[8]。2016 年，蘇州醫工所采用鈦寶石飛秒激光器和OPO 泵浦，實現了雙光子STED 超分辨成像

雙光子STED 復合顯微成像技術對深層生物組織成像具有較大的優勢，在神經疾病臨床診斷及腦科學研究方面具有廣闊的應用前景，但該技術大都還處于方法研究的實驗階段，系統功能和集成穩定性等都無法滿足臨床實際要求[9-13]。對此本文自主研制了雙光子STED 復合顯微鏡成像系統，并對其成像特性進行了研究。

1 復合顯微鏡成像系統

雙光子STED 復合顯微鏡系統如圖1 和2 所示，主要包括五個部分：入射激光①、光束合束選通模塊②、掃描模塊③、熒光探測模塊④和正置熒光顯微鏡⑤。

掃描模塊③與正置熒光顯微鏡⑤構成一個整體，該正置顯微鏡內分三層，包括透射照明光路、熒光入射照明光路、目視觀察光路，可以實現普通寬場熒光顯微鏡的基本功能。圖2 最上層38 為三目頭筒鏡，用于目鏡目視觀察或寬場成像；中間層35 為寬場熒光照明層，36 為聚光透鏡，37 為熒光照明光纖頭；下層為掃描模塊；34 為顯微物鏡。

2 雙光子STED 復合顯微成像技術研究

2.1 多波長選通

1） 激發波長選通

入射激光部分主要包括寬波段連續譜激光器和雙光子成像激光器。寬波段連續譜激光器為皮秒脈沖激光，脈寬為100 ps 左右，光譜范圍為450～1 700 nm，用于紅綠雙色熒光成像和STED超分辨成像，經光纖傳導并準直輸出。雙光子成像激光器提供用于雙光子成像的高能量飛秒脈沖激光，脈寬為100 fs，波長為780 nm，光束直徑為1.2 mm 并準直輸出。

采用Chroma 公司的ZT532RDC-XT 二色鏡對入射光進行分光，其中592 nm 和780 nm 波長激光的透射率為大于95%，而488 nm 波長的激光被反射，從而入射激光被該二色鏡分為激發光和STED 損耗光兩路并被分別調制。對于不同的成像方式，采用了不同的激光和濾光片組合。

圖1 雙光子STED 復合顯微鏡光學系統圖Fig.1 Optical system for 2P STED composite microscope

圖2 顯微鏡鏡體內光學布局側視圖Fig.2 Side view of optical layout in the microscope

■ 綠色熒光掃描成像：采用寬波段連續譜激光器作為激發光源，并用一個中心波長為488 nm、波長帶寬為10 nm 的帶通濾光片濾出所需要的激發光。

■ 紅色熒光掃描成像：采用寬波段連續譜激光器作為激發光源，并用一個中心波長為561 nm、帶寬為24 nm 的帶通濾光片濾出所需要的激發光。

■ 雙光子成像：采用雙光子成像激光器作為激發光源，該激光器發出的780 nm 飛秒激光能夠透過二色鏡和濾光片進入到后續光路中，為系統提供雙光子成像需要的激發光。

■ STED 超分辨成像：損耗光采用中心波長為592 nm、帶寬為50 nm 的激光束，并用濾光片提供所需要的損耗光束。

2） 紅綠熒光探測濾波

本文復合顯微鏡可以實現紅色和綠色雙色熒光通道成像，紅綠熒光選擇則根據需要在掃描模塊中切換相應的二色鏡及濾光片來實現。

■ 綠色熒光成像時：使用綠色熒光成像二色鏡26.1，其作用是透過488 nm、592 nm、780 nm的入射激光，并使其入射到樣品上，而將525 nm熒光信號光反射給探測模塊。與其配合使用的綠色熒光成像濾光片28，其通光范圍中心波長為525 nm，帶寬為50 nm，該綠色熒光濾光片可手動切入或切出光路。

■ 紅色熒光成像時：使用紅色熒光成像二色鏡，其作用是透過561 nm 的入射激光，使其入射到樣品上，而將620 nm 熒光信號光反射給探測模塊。與其配合使用的紅色熒光濾光片，其通光范圍是590～650 nm（紅色熒光濾光片和紅色熒光二色鏡作為一個組件集成在一起）。

綠色熒光成像二色鏡和紅色熒光成像濾光片組件（二色鏡、濾光片）設置在一個可手動切換位置的可移動滑軌上。當進行綠色熒光掃描成像時，將綠色熒光濾光片切入到光路中，當進行紅色熒光掃描成像時，將該濾光片切出光路。

2.2 多光束合束

本系統涉及三路激光光束，兩束來自超連續譜激光器分光，一束來自雙光子飛秒激光器。雙光子STED 復合成像則需要將三路激光經物鏡后聚焦于同一點上，因此，首先要對系統進行多光束合束的精密調節，采用電控可調俯仰的二色鏡機構可方便監測和調整光束精密合束。

對于STED 成像，其損耗光的最小光強處應與激發光的最大光強處精確重合。這樣，可使外圍熒光被較強損耗，而中央較強熒光被保留，以達到較好的超分辨效果。我們采用直徑為60 nm的金納米顆粒和精密三維納米位移臺，分別用488 nm 和592 nm 兩束光對金粒子樣本進行成像，利用位移臺對其進行掃描，探測金粒子背向散射光并進行成像，以此來測定激光聚焦點點擴散函數，評價系統性能，指導系統裝調。金粒子成像結果如圖3 所示，激發光與損耗光在物鏡焦點附近實現了XY 平面的精確重疊，重合精度可達20 nm，滿足系統成像要求。

當488 nm 和592 nm 激光合束完成以后，關閉488 nm 激光并打開780 nm 雙光子激光，采用同上的金粒子掃描成像方法，通過調節反射鏡，將780 nm 激光調節至與592 nm 激光重合，最后達到三路激光均精密重合的目的。

2.3 關鍵性能指標測定

1） 雙光子成像深度

圖3 點擴散函數XY 平面掃描成像Fig.3 Point spread function scanning imaging in XY plane

雙光子成像深度是指雙光子可以清晰成像的最大深度。測試過程中使用瓊脂糖包裹的熒光微球作為成像標本，用雙光子方式對其進行成像，樣本成像深度位置是通過在豎直方向移動樣本來實現，并采用千分表對移動行程進行測量，繼而測量出成像清晰的深度。對兩個不同深度位置成像時，千分表對應的讀數為199.5 μm 和908.5 μm，對應雙光子圖像均清晰可見，如圖4 所示，因此對應的成像深度為709.0 μm。

2） STED 成像橫向分辨率

圖4 不同深度熒光微球雙光子成像Fig.4 2P imaging of fluorescent microspheres with different depth

橫向分辨率是指顯微鏡成像在水平面（XY 面）內的分辨能力。業內均采用測量熒光微球成像的半高全寬評價此類顯微鏡的橫向分辨率。測試時使用熒光微球作為樣本，通過移動納米位移臺實現對樣品掃描成像，并設置掃描步距為20 nm。由于熒光微球存在尺寸不均一以及團聚的現象，微球的成像點大小不一，其中較小的點代表雙光子STED 顯微鏡的分辨率。測算強度曲線半高全寬在X 方向上對應的像素數，得到橫向分辨率約為58 nm，如圖5 所示。

圖5 熒光微球成像測定分辨率Fig.5 Resolution measurement by fluorescence microsphere imaging

圖6 雙光子-STED 復合顯微鏡樣機Fig.6 2P STED composite microscope prototype

2.4 系統成像研究

在各個模塊研制完成的基礎上，對系統進行集成，組裝集成后形成了一個完整的顯微鏡樣機，如圖6 所示。樣可以實現包括共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED 超分辨成像等在內的多種模式成像，并可在成像模式間互相切換。

經實驗可知，雙光子STED 復合顯微鏡樣機成功實現了紅綠雙色熒光掃描成像、熒光原位雜交技術（FISH）成像、對鼠腦神經纖維的雙光子成像以及對皮膚組織的無標記二次諧波成像。此外，通過三維平移臺改變樣品垂直方向上的高度，還實現了深層成像和分層成像，如圖7～10所示。

對48 nm 直徑熒光微球分別進行熒光掃描成像和STED 超分辨成像，從成像效果中可以明顯看出，熒光掃描圖像中很多微球團聚在一起無法分辨，而STED 成像卻可以清晰分辨，說明成像分辨率有明顯的提升，如圖11 所示。

圖7 熒光原位雜交技術（FISH）成像Fig.7 Fluorescence in-situ hybridization(FISH) imaging

圖8 鼠腦雙光子成像Fig.8 2P imaging of brain.

圖9 皮膚二次諧波成像Fig.9 Second harmonic imaging of skin.

圖10 雙光子深度成像Fig.10 2P depth imaging

圖11 熒光微球超分辨成像對比Fig.11 Super resolution imaging comparison of fluorescent microsphere

3 結 論

雙光子STED 復合顯微鏡在深層生物組織成像方面具有較大的優勢，在神經疾病臨床診斷及腦科學研究方面具有廣闊的應用前景。本文對雙光子STED 復合顯微成像中相關技術進行了研究，采用多濾光片組合與切換的方式實現了488 nm、561 nm、592 nm 和780 nm 多波長激光的選通及紅綠雙通道熒光探測。采用金粒子掃描成像的方法實現了雙光子、激發光、STED 損耗光多光束精密合束，重合精度約為20 nm，探討了系統成像深度、STED 成像分辨率的定量檢測方法。該復合顯微鏡可以對熒光標記的樣本進行掃描成像，具備紅綠雙色熒光掃描成像功能、雙光子綠色熒光成像功能和STED 超分辨綠色熒光成像功能。一般采用雙色熒光掃描成像即可完成染色體等的熒光成分分析或進行FISH 成像，對于較厚的樣本可以采用雙光子深層成像，對于要求較高分辨率的情況可以采用STED 超分辨成像。經測試可得，系統的成像深度達到700 μm，STED 成像分辨率優于60 nm。在完成雙光子STED 復合顯微鏡系統研制的基礎上，接下來我們將對該系統開展在臨床上的應用研究。