外泌體lncRNA干擾素誘導GTP酶假基因1在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

章喜林 余歡明 王翔

腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境和惡性進展過程中發揮重要調控作用。相關研究發現，肺癌組織周圍浸潤大量巨噬細胞，進而影響細胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤轉移、血管生成、免疫抑制，促進腫瘤的惡性進展[1-2]。在不同因子的刺激下，巨噬細胞被激活成M1型或M2型，并發揮不同的功能。鑒于此，有學者提出了靶向巨噬細胞的治療方法[3]。但是關于腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤轉移的機制以及調控腫瘤微環境的作用，目前尚未清楚。近年來，研究發現腫瘤來源外泌體可攜帶大量蛋白質或核酸并傳遞到受體細胞或微環境中，從而影響細胞與細胞和（或）細胞與微環境之間的信號調控，進而促進腫瘤轉移和惡性進展[4-6]。研究表明，非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）外泌體可通過釋放晶體蛋白甲B來調控M2型巨噬細胞表型轉化，進而促進腫瘤轉移[7]。另有研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）干擾素誘導GTP酶假基因1（GVINP1）的表達與肺腺癌患者的預后密切相關[8]，但其在NSCLC外泌體中的表達及臨床意義未見相關報道，本研究對此進行探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年10月至2018年2月在湖州師范學院附屬第一醫院手術并經病理組織學檢查確診為NSCLC的患者51例（收集外周血標本前未予抗腫瘤治療），其中男24例，女27例；年齡28～80（60.73±14.05）歲；腫瘤組織高分化12例，中分化31例，低分化8例；國際抗癌聯盟第8版肺癌TNM分期[9]：Ⅰ期28例，Ⅱ期12例，Ⅲ期7例，Ⅳ期4例；有淋巴結轉移5例，無淋巴結轉移46例。另選取本院同期健康體檢者45例作為對照，其中男21例，女24例；年齡36～88（60.48±11.88）歲。收集兩組對象的外周血標本。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 ExoQuickTMExosome Isolation Reagent購自美國 SBI公司（5 ml，EXOQ5A-1）；Total Exosome Isolation（from cell culture media）試劑（50 ml，4478359）、Trizol試劑（100 ml，15596018）購自美國 Invitrogen 公司；5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（RR036A）、SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A）購自大連寶日生物Takara公司；CD9（sc-13118）、CD81（sc-166029）、Alix 抗體（sc-53540）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；脂多糖（1 mg，L2654）購自日本 Sigma公司。NanoDrop 2000分光光度計購自 ThermoFisher Scientific公司；Applied Biosystems 7500 RT-PCR儀購自美國ABI公司；透射電子顯微鏡G2 spititi FEI購自Tecnai公司；納米顆粒跟蹤分析儀（ZetaView Particle Metrix）購自德國PMX公司。

1.3 細胞培養和處理 人正常肺上皮細胞（BEAS-2B）、巨噬細胞（RAW264.7）和 NSCLC 細胞（A549、H1299）購自中國科學院干細胞庫，所有細胞用完全培養基DMEM（Hyclone）+10% FBS（Gibco）+100 U/ml penicillin（Sigma）和 100 mg/L streptomycin（Sigma）培養。待細胞密度為70%～80%，加入無血清的培養基繼續培養48 h，收集選擇性培養基用于后續實驗。細胞選擇性培養基對巨噬細胞表型轉化影響的實驗分為5組，包括空白對照組（DMEM培養基）、脂多糖組、BEAS-2B-CM組、A549-CM組、H1299-CM組，分別用DMEM培養基、500 μg/L脂多糖、BEAS-2B培養基、A549培養基、H1299培養基處理RAW264.7細胞24 h。細胞選擇性培養基外泌體對巨噬細胞表型轉化影響的實驗分為3組，包括BEAS-2B組、A549組、H1299組，分別用BEAS-2B培養基、A549培養基、H1299培養基提取的細胞外泌體處理RAW264.7細胞24 h。

1.4 外泌體提取 （1）血漿外泌體提?。喝】崭轨o脈血5 ml，室溫靜置 30 min，3 500 g 離心 5 min，取血漿；利用外泌體提取試劑盒（EXOQ5A-1，SBI）提取血漿外泌體。取1 ml血漿加入10 μl Thrombin旋轉混勻20 min，10 000g 離心 5 min；取上清液，加入 252 μl ExoQuickTMExosome Isolation Reagent混勻，4 ℃孵育 30 min，1 500g離心30 min，去除上清液。取部分沉淀溶于PBS中，用于電鏡下觀察和納米顆粒跟蹤分析法鑒定；部分沉淀溶于Trizol試劑中，用于RT-PCR檢測；部分沉淀溶于RIPA裂解液中，用于Western blot檢測。（2）細胞選擇性培養基外泌體提?。?0 ml選擇性培養基經梯度離心、0.22 μm過濾后，加入15 ml Total Exosome Isolation（from cell culture media）試劑，4℃孵育過夜，10 000 g離心60 min，去除上清液，將沉淀溶于Trizol試劑中，用于RT-PCR檢測。

1.5 外泌體電鏡下觀察與納米顆粒跟蹤分析法鑒定（1）外泌體固定于銅網上，靜置1 min，2%醋酸雙氧鈾水室溫染色1 min，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。（2）外泌體經PBS稀釋后，采用納米顆粒跟蹤分析法測定顆粒濃度及直徑。

1.6 CD9、CD81和Alix蛋白表達檢測 采用Western blot法。外泌體溶于RIPA裂解液中提取總蛋白，12 000 g、4℃離心10 min，取等體積樣品經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳；然后將蛋白轉印至0.45 μm PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入CD9、CD81和Alix特異性抗體4℃孵育過夜。PVDF膜經PBST充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠（1∶2 000）室溫孵育1 h。利用ECL化學發光法檢測外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白表達，利用Tanon 5200全自動化學發光成像系統獲取電泳圖。

1.7 GVINP1及炎癥因子mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。按照Trizol試劑說明書提取總RNA，分別將血漿和細胞選擇性培養基外泌體RNA溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）水，經NanoDrop 2000檢測總RNA的質量和純度，用 5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）逆轉錄成cDNA。合成的cDNA利用SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）進行 PCR 擴增，20 μl反應體系包括 10 μl SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、0.6 μl上游引物、0.6 μl下游引物和 50 ng cDNA；反應程序為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。PCR 擴增結束后，采用2-ΔΔCt法計算GVINP1及炎癥因子mRNA表達水平，每個樣本設3個平行孔。所用引物序列見表1。1.8 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者外周血外泌體的觀察與鑒定 在電鏡下可見NSCLC患者外周血中含有豐富的外泌體，見圖1a；外泌體大小為 26.7～136.1 nm，見圖 1b。

2.2NSCLC患者與健康體檢者血漿外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白及GVINP1 mRNA表達水平比較 NSCLC患者和健康體檢者血漿外泌體中都存在CD9、CD81和Alix蛋白表達，見圖2a；NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1 mRNA表達水平明顯高于健康體檢者，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2b。

2.3 不同臨床特征NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1的mRNA表達水平比較 有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1表達水平較低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.4 NSCLC細胞選擇性培養基中外泌體GVINP1 mRNA表達水平比較 與人正常肺上皮細胞（BEAS-2B）選擇性培養基外泌體比較，NSCLC細胞（A549、H1299）選擇性培養基外泌體中GVINP1 mRNA表達水平均明顯升高（均 P＜0.05），見圖 3。

2.5 NSCLC細胞選擇性培養基對巨噬細胞表型轉化的影響 與空白對照組比較，BEAS-2B-CM組、A549-CM組、H1299-CM 組 IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平均明顯升高（均P＜0.05），見圖4a-c；而A549-CM組、H1299-CM組IL-10 mRNA水平明顯降低（P＜0.05），見圖4d。

表1 RT-PCR引物序列

圖1 非小細胞肺癌（NSCLC）患者外周血外泌體的觀察與鑒定（a：電鏡下觀察；b：納米顆粒跟蹤分析法測得外泌體顆粒濃度及直徑）

圖2 NSCLC患者與健康體檢者血漿外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白及GVINP1 mRNA表達水平比較（NSCLC為非小細胞肺癌，GVINP1為干擾素誘導GTP酶假基因1；a：CD81、CD9和Alix蛋白表達的電泳圖；b：GVINP1 mRNA表達水平的比較，與健康體檢者比較，*P＜0.05）

表2 不同臨床特征NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1 mRNA表達水平比較

圖3 NSCLC細胞選擇性培養基外泌體中GVINP1 mRNA表達水平比較（NSCLC為非小細胞肺癌，GVINP1為干擾素誘導GTP酶假基因 1；與 BEAS-2B 比較，*P＜0.05）

2.6 NSCLC細胞選擇性培養基外泌體對巨噬細胞表型轉化的影響 與去除外泌體的選擇性培養基比較，BEAS-2B 組、A549組、H1299組外泌體中 IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達水平均明顯升高（均P＜0.05），見圖5a-c；而A549組、H1299組外泌體中IL-10 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖 5d。

3 討論

肺癌是我國發病率和死亡率較高的腫瘤之一，其中以NSCLC最為常見[10]。由于早期缺少有效的診斷指標，多數患者被發現時已處于晚期，失去了最佳手術治療時機，而且晚期患者對化療藥物不敏感，5年生存率僅15%左右[10]。因此，尋找一種新的診斷指標，實現肺癌轉移早期診斷與預后判斷具有重要意義。

lncRNA是一類長度＞200核苷酸、保守性較低但具有高度組織特異性的非編碼RNA[11]。前期研究發現，lncRNA是重要的調控分子，在NSCLC發生、發展和轉移中具有重要作用[12-13]。國內外學者研究發現，HOTAIR[14]、MALAT1[15]、H19[16]、CCAT2[17]等多種 lncRNA 在肺腺癌中高表達，且其表達與肺腺癌診斷和治療密切相關。Sui等[8]提取TCGA數據庫的數據分析發現，GVINP1在肺腺癌中低表達，其與 CEBPA-AS1、MIR31HG、RAET1K聯合檢測可作為肺腺癌預后判斷的潛在標志物。本研究結果發現，GVINP1在NSCLC細胞選擇性培養基的外泌體中表達水平升高，這表明細胞可選擇性釋放攜帶GVINP1外泌體并作用于受體細胞，從而影響細胞功能。筆者在NSCLC患者血漿外泌體中也發現了相同的結果，且其表達與患者TNM分期、淋巴結轉移有關，這與先前肺腺癌組織中的研究結果不一致[8]，表明GVINP1可能具有雙重作用。多項研究表明，lncRNA在癌癥進展中可表現為兩面性。如MALAT1通過激活或失活相鄰前轉移轉錄因子（TEAD）可促進或抑制乳腺癌轉移[18]；DDX3在肺癌進展中也存在雙重作用，一方面可激活Wnt信號通路來促進肺癌進展，另一方面可激活MDM2/Slug/E-cadherin信號通路來抑制肺癌進展[19]。這些結果表明，GVINP1在NSCLC癌組織和外泌體中可能發揮著不同功能，抑制或促進肺癌進展。

圖4 非小細胞肺癌（NSCLC）細胞選擇性培養基對巨噬細胞表型轉化的影響（a：IL-1β mRNA表達水平；b：TNF-α mRNA表達水平；c：IL-6 mRNA 表達水平；d：IL-10 mRNA 表達水平；*P＜0.05）

腫瘤相關巨噬細胞是一類浸潤在腫瘤組織中的單核細胞，是腫瘤微環境的重要組成部分。大量研究表明，這類細胞可參與調控腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移、耐藥等多個過程，從而促進腫瘤惡性進展。近年來，鑒于腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境中的重要調控作用，有學者提出靶向腫瘤相關巨噬細胞的治療方式并取得了明顯效果，使患者生存質量有了明顯提升[3]。前期研究發現，M2型巨噬細胞可介導上調晶體蛋白甲B表達，促進NSCLC細胞遷移和腫瘤轉移[7]。本研究結果也發現，NSCLC細胞選擇性培養基和外泌體處理巨噬細胞可促進M2型巨噬細胞活化。這些結果表明NSCLC可能介導上調外泌體GVINP1表達，促進M2型巨噬細胞活化，從而促進腫瘤進展。

綜上所述，本研究首次闡明了NSCLC細胞外泌體可促進M2型巨噬細胞轉化，并發現NSCLC細胞和NSCLC患者外周血中的外泌體GVINP1表達明顯升高，且與患者TNM分期、淋巴結轉移有關，提示NSCLC可能介導外泌體GVINP1調控巨噬細胞表型轉化，從而促進腫瘤惡性進展。但本項目也存在一定的不足，如不能直接證明外泌體GVINP1在巨噬細胞表型轉化中的作用，還需要更多證據去證明外泌體GVINP1在NSCLC組織和巨噬細胞以及腫瘤微環境中的作用及機制，為NSCLC患者預后改善提供新的靶點。

圖5 非小細胞肺癌（NSCLC）細胞選擇性培養基外泌體對巨噬細胞表型轉化的影響（a：IL-1β mRNA表達水平；b：TNF-α mRNA表達水平；c：IL-6 mRNA 表達水平；d：IL-10 mRNA 表達水平；*P＜0.05）