肝靶向肽修飾的人內皮抑制素rES-CSP融合蛋白可溶性表達及活性鑒定

余田甜， 張晶晶， 許敏華， 金小寶， 汪 潔， 馬 艷

(廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室， 廣州 510006)

內皮抑制素(Endostatin，ES)是膠原蛋白 XVIII C 末端一個分子質量為20 ku的內源性血管抑制因子[1-2]，能夠抑制血管內皮細胞增殖、遷移和黏附，以及一些腫瘤細胞增殖和遷移等，具有廣譜抗腫瘤作用[3-5]。臨床試驗發現，ES半衰期短，治療腫瘤所需劑量較大，又需持續給藥[6]。另外，ES在體內各組織均有分布，對正常生理狀態下的新生血管形成有潛在的毒副作用[7]。CSP I-plus是瘧原蟲環子孢子蛋白(Circumsporozoite protein，CSP)N端保守I區；包含保守序列 KLKQP 和硫酸肝素結合序列，是瘧原蟲子孢子吸附與入侵肝細胞的關鍵[8]，具有肝靶向性。本課題組提出將CSP I-plus與重組人內皮抑制素(Recombinant human endostatin, Endostar, 商品名：恩度)進行融合制備融合蛋白rES-CSP，用于靶向治療肝細胞癌。

本課題組已成功構建rES-CSP表達載體，并誘導表達出融合蛋白rES-CSP。實驗證實該蛋白能夠抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移、小管形成，抑制雞胚尿囊膜模型新生血管的形成，同時能與肝癌細胞HepG2靶向結合[9]；裸鼠肝癌模型實驗表明rES-CSP對肝癌新生血管生成和腫瘤生長具有抑制作用，對裸鼠主要臟器沒有明顯影響[10]。但此前研究中，誘導表達獲得rES-CSP是以包涵體形式存在。包涵體是蛋白質凝聚形成的非常致密顆粒，沒有活性，需要經過復雜的變性和復性才能獲得有活性的目的蛋白，然而在此過程中容易導致目的蛋白降解而失活[11-12]。本文通過優化誘導表達條件，實現融合蛋白rES-CSP可溶性表達，以便于獲得大量的有活性rES-CSP，使該融合蛋白作為藥用蛋白大規模生產成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

恩度(Endostar)，山東先聲麥得津生物制藥有限公司； HisTrap Kit親和層析填料、XK 16/20層析空柱及HiTrapTM脫鹽柱，購自GE healthcare公司；異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)、咪唑， 購自Sigma公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自Oxoid公司；Anti-6×His鼠多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG HRP標記二抗，購自Santa cruz公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺和TEMED購自BioRad公司。

1.1.2 載體、菌株和細胞株

表達載體rES-CSP /pET21b、感受態E.coliBL21(DE3)、人肝癌細胞HepG2由廣東藥科大學廣東省生物活性藥物研究重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 rES-CSP/pET21b/BL21重組菌株的誘導表達

將陽性表達載體rES-CSP /pET21b轉化到E.coliBL21(DE3)感受態中，涂于含有100 μg/mL Ampicillin的LB平板篩選，挑取單菌落接種到含100 μg/mL Ampicillin LB培養基中，37 ℃，180 r/min，培養過夜。將此菌液按1∶100(V/V)接種到LB培養基中，培養約2.5 h(OD600≈0.6)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導表達。在誘導前、誘導后4 h分別收集菌體進行SDS-PAGE，Bandscan 5.0分析目的蛋白占菌體總蛋白的百分比，選取目的蛋白表達量最高的菌株作為后續試驗菌株。

1.2.2 rES-CSP可溶性表達條件的優化

1)誘導溫度的優化。按上述方法，將表達量最高的rES-CSP/pET21b/BL21培養至OD600≈0.6，再加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，分別在20、25、30和37 ℃誘導培養20 h，4 ℃離心收集菌體。用1×PBS洗滌菌體2次，稱其濕重，并將菌體按1∶8(W/V)的比例懸浮在裂解緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0) 中，冰上超聲裂解，離心，取超聲裂解后的總蛋白、離心上清、離心沉淀進行Western Blot檢測，確定rES-CSP可溶性表達量最高的誘導溫度。

2)誘導時間的優化。方法同1)，在rES-CSP可溶性表達量最高的誘導溫度下，分別誘導表達5、10、15、20、25和30 h收集菌體，取超聲裂解后的離心上清進行Western Blot檢測，確定rES-CSP可溶性表達量相對最高的誘導時間。

1.2.3 rES-CSP的純化及RP-HPLC分析

融合蛋白按優化后確定的誘導溫度和誘導時間進行可溶性誘導表達，收集菌體超聲裂解，按GE公司KTA purifierTM層析系統UPC 10操作說明，分別采用Ni-NTA親和層析柱和HiTrapTM脫鹽柱對裂解上清純化和去鹽[13]，再使用 Millipore Amicon-Ultra-15 10 ku超濾管進行濃縮；最后RP-HPLC檢測融合蛋白的純度。

1.2.4 CCK-8檢測rES-CSP對HepG2細胞增殖的影響

將人肝癌細胞 HepG2 5×103個/孔接種于96孔板； 待貼壁后，分別加入終濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL rES-CSP或Endostar，5個復孔，培養48 h。加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h。酶標儀OD450測光吸收值，計算細胞的生長抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組平均OD/對照組平均OD)×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測rES-CSP 的靶向性

將含100 μg/mL endostar或rES-CSP的HepG2、Chang’s、A549和HCM細胞，37 ℃培養1 h，不處理組為空白對照。收集各組細胞，4%多聚甲醛固定10 min，加入Anti-ES一抗或同型對照抗體，37 ℃孵育1 h；加入PE標記二抗，37 ℃避光孵育30 min；上流式細胞儀檢測細胞表面的熒光強度。

1.2.6 統計學分析

計量資料以平均數±標準差(n=3)表示，數據統計采用SPSS13.0統計軟件中的單因素方差分析，以P<0.05作為差異有顯著意義。

2 結果與分析

2.1 rES-CSP/pET21b/BL21重組菌株的誘導表達

挑取轉化后的3個單菌落進行誘導表達，在誘導前菌體中未出現目的條帶，而誘導后的菌體在15 ku和25 ku之間約23 ku處出現目的條帶，與融合蛋白分子質量大小相符；Bandscan 5.0分析得知：3株菌表達目的蛋白分別約占總蛋白的32.46%、43.84%和27.41%。因此本實驗選用第二個菌株進行可溶性誘導表達(圖1)。

M: Protein Marker; 1、3和5: 誘導前總蛋白；2、4和6: 誘導后總蛋白

2.2 rES-CSP可溶性誘導表達條件的優化

1)誘導溫度的優化。溫度是影響可溶性誘導表達的主要因素，適當降低溫度能有效地增加目的蛋白可溶性比例。為了獲得可溶性rES-CSP，考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃ 4個誘導溫度對目的蛋白可溶性表達水平的影響。Western Blot結果表明，在25 ℃，rES-CSP可溶性表達量最高，且具有統計學差異(P<0.05)。隨著溫度升高，rES-CSP可溶性表達量降低，在37 ℃時主要為包涵體表達(圖2)。

2)誘導時間的優化。誘導時間對目的蛋白的表達量及其活性的影響較大[12]。為了獲得更多可溶性目的蛋白，考察了6個誘導時間對融合蛋白可溶性表達水平的影響。Western Blot結果顯示，隨著誘導時間延長可溶性表達量增加，達到飽和后不利于目的蛋白表達。從統計結果看出在誘導時間為20 h時，rES-CSP可溶性表達量相對較高(P<0.05)，具體見圖3。

A為Western Blot印跡分析rES-CSP/pET21b/BL21在不同溫度下的表達(1、4、7和10裂解總蛋白， 2、5、8和11為裂解上清， 3、6、9和12為裂解沉淀)；B為Bandscan 5.0掃描分析裂解上清液中靶蛋白的體積

A為Western Blot分析不同誘導時間的裂解上清液中的靶蛋白；B為Bandscan 5.0掃描分析靶蛋白的體積

2.3 rES-CSP可溶性融合蛋白的表達純化及RP-HPLC分析

可溶性誘導表達的菌體經超聲裂解后收集上清，采用Ni-NTA親和層析柱進行純化，在洗脫液體積20～30 mL之間，有一特異性洗脫峰，SDS-PAGE結果表明此洗脫峰為rES-CSP可溶性融合蛋白目的峰(圖4)； RP-HPLC顯示 rES-CSP純度高達98%以上(圖5)。

圖4 rES-CSP融合蛋白純化洗脫峰形圖(A)和SDS-PAGE分析(B)

柱子規格：Venusil ASB C18(T) 4.6×150 mm；條件：流動相體系水∶乙腈(90∶10)；流速0.5 mL/min

2.4 rES-CSP 融合蛋白對HepG2細胞增殖的影響

為了確定可溶性融合蛋白rES-CSP的生物學活性，首先采用CCK-8法檢測了rES-CSP對人肝癌細胞HepG2增殖的影響。結果顯示，rES-CSP能抑制HepG2增殖，并具有劑量依賴性。與Endostasr相比，rES-CSP對HepG2抑制作用明顯增強(圖6)。

圖6 Endostar和rES-CSP對HepG2的48 h作用分析

2.5 流式細胞術檢測rES-CSP 的靶向性

流式細胞儀檢測結果表明：與Endostar相比，rES-CSP在人肝細胞Chang’s和人肝癌細胞HepG2中的熒光強度顯著增強；而rES-CSP在人肺癌細胞A549和人心肌細胞HCM中的熒光強度與Endostar無明顯差異。說明CSP I-plus 修飾的內皮抑制素與肝細胞和肝癌細胞結合能力增強，尤其與肝癌細胞結合能力具有顯著性差異(P<0.05)，見圖7。

圖7 流式細胞術檢測融合蛋白與不同來源細胞的結合能力

3 討論與結論

蛋白質動力學模型研究表明,蛋白合成速率、蛋白折疊速率和蛋白聚集速率共同決定了活性蛋白的產率。降低重組蛋白合成速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達水平。常用的方法有降低培養溫度、改變培養基成分、選擇合適的誘導條件。一般情況下通過調節培養基pH值，誘導劑IPTG濃度，起始菌的濃度，融合蛋白的等電點，誘導溫度和誘導時間等實現目的蛋白的可溶性表達[10-11,13-14]。而大腸桿菌最適生長溫度是37 ℃～39 ℃，大腸桿菌表達系統在此溫度下誘導表達的外源蛋白含量較高，但極易形成包涵體；而在低溫條件下誘導表達，能有效地增加外源蛋白可溶比例，降低可溶性蛋白的降解速率，提高其穩定性[15]。一般大腸桿菌培養下限溫度為8 ℃～10℃，此時大腸桿菌將停止表達外源蛋白[16]。誘導時間影響大腸桿菌表達可溶性外源蛋白含量，如果誘導時間過短，會造成目的蛋白產量偏低，如果誘導時間過長，絕大部分目的蛋白往往會以包涵體的形式表達，雜蛋白量也會相對提高[17]。

本研究首先在常規條件下誘導表達，獲得目的蛋白分子質量大小約23 ku，與預期的融合蛋白分子質量大小一致。后續對影響融合蛋白可溶性表達的主要因素誘導溫度和誘導時間進行優化，Western Blot結果表明：在20 ℃、25 ℃和30 ℃實現目的蛋白可溶性表達，其中在25 ℃，rES-CSP融合蛋白可溶性表達量最高；隨著誘導時間延長rES-CSP可溶性表達量增加，當誘導時間為20 h時，rES-CS表達量達到最高；最后確定rES-CSP可溶性誘導表達條件：溫度25 ℃，時間20 h。融合蛋白rES-CSP的N端帶有6×His標簽，能與金屬Ni2+特異性結合，采用Ni-NTA親和層析柱分離純化，獲得高純度融合蛋白rES-CSP。CCK-8結果顯示rES-CSP對HepG2細胞有生長抑制作用且具有濃度依賴性；此外，流式細胞術發現，與Endostar相比，可溶性rES-CSP與肝細胞和肝癌細胞的結合能力增強，說明可溶性rES-CSP具肝靶向性。該研究確定了融合蛋白rES-CSP可溶性表達條件，使其大規模生產成為可能，為進一步研究其生物學活性及藥物開發奠定基礎。