森林草莓DDM1基因RNAi干擾載體的構建及功能分析

王 蕾， 顧婷婷， 甘立軍

(1. 南京農業大學 生命科學學院， 南京 210095； 2. 南京農業大學 園藝學院， 南京 210095)

在植物中，DNA甲基化主要參與了基因的表達調控，進而對植物生長發育產生影響[1]。DNA甲基化會影響植物的生長發育、器官分化等生物過程，尤其是在植物春化作用與開花，正?；ㄆ鞴俚男纬膳c發育，內源基因表達和轉基因植株的基因沉默等過程中有重要作用[2]。DNA甲基化主要發生在對稱的CG, CHG和不對稱CHH位點中(H代表A、C或T)，其中CG和CHG位點的甲基化是最主要的甲基化形式。DNA甲基化對植物的生長發育主要起調控作用，CG(mCG)位點的甲基化是在DNA復制過程中由甲基轉移酶1(Methyltransferase1, MET1)維持，是植物基因組中最豐富的DNA甲基化形式[3-4]。植物特異性染色質域甲基轉移酶3(Chromomethylase, CMT3)主要負責CHG(mCHG)位點的甲基化[5-9]。域重排甲基轉移酶(Domains rearranged methyltransferase, DRM)的結構和哺乳動物的Dnmt3甲基化酶相似，對CHH非對稱位點的從頭甲基化及維持失活轉座子及轉基因沉默位點的胞嘧啶甲基化進行修飾，同時，DRM也參與RNA介導的甲基化過程[10-13]。

DDM1(Decrease in DNA methylation1)是一種Snf2家族的核糖體重塑蛋白，在植物體中對保持CG和非CG位點甲基化起著非常重要的作用[14-15]。DDM1可以通過水解ATP改變核小體的組成和位置，從而允許其他甲基轉移酶進入DNA[11,16]。近來的研究表明，擬南芥中DDM1的破壞導致異染色質TEs和其他DNA重復序列中所有類型的DNA甲基化顯著減少[15,17-18]。除擬南芥外，ddm1突變體已在玉米和水稻中分離得到，均含有兩個ddm1同源基因，在玉米中，兩個單一T-DNA插入功能喪失的ddm1突變體顯示非CG背景下甲基化顯著降低[19]。在水稻中，功能缺失的單突變體Osddm1a和Osddm1b沒有明顯的表型，但在雙突變體中觀察到嚴重的生長缺陷，3種位點的甲基化都有顯著的降低[20]。為了探究DDM1基因對森林草莓發育過程的影響，通過構建草莓中DDM1基因的RNAi干擾載體，并通過草莓葉片農桿菌轉化方法獲得轉基因草莓，來降低草莓中DDM1基因的表達量，觀察轉基因株系的表型，從而進行DDM1基因在草莓生長發育過程中的功能研究，這為以后研究甲基化對草莓生長發育的影響提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

二倍體森林草莓(Fragariavesca, Ruegen F7-4)，于(25±2) ℃組培室內培養，光周期為16 h/8 h(光/暗)。大腸桿菌DH5α、農桿菌EHA105以及p2300GRN-35S-faq-nos的RNAi表達載體均由本實驗室保存。

KOD FX DNA聚合酶(TaKaRa)、限制性內切酶(Thermo Fisher)、rTaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒等購自Axygene公司；Infusion一步克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 正向片段DDM1-1的片段的克隆和回收

根據FveDDM1基因全長cDNA序列，利用Snapgene和Primer Premier 5軟件設計含有同源臂的引物，以野生型森林草莓的cDNA為模板，分別采用引物F1/R1(表1)進行PCR擴增，獲得正向片段DDM1-1(412 bp)。按照KOD FX說明書進行反應體系配制。PCR程序：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；延伸溫度68 ℃，延伸時間根據擴增片段長度來計算(1 kb/min)，最后68 ℃延伸10 min后結束，總共35個循環。使用凝膠回收試劑盒對獲取的目的片段進行純化回收，并置于-20 ℃保存。

表1 本實驗所用引物序列

1.2.2 中間載體的構建

用限制性內切酶SalⅠ對p2300GNR-35S-faqr-nos的載體骨架進行酶切后，回收載體片段。將擴增好的含有同源臂的正向片段和回收的載體片段按照Infusion一步克隆試劑盒說明書進行連接。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，挑取抗卡拉霉素的單克隆進行菌落PCR驗證，將鑒定所得陽性重組質粒送公司進行測序，連接正確的重組質粒命名為p35S-DDM1-1-RNAi。

1.2.3 反向片段DDM1-2的擴增和DDM1基因干涉表達載體的構建

以中間載體p35S-DDM1-1-RNAi為模板，利用含有同源臂的引物F2/R2進行PCR擴增，獲得反向片段DDM1-2(412 bp)。同時用XbaⅠ對中間載體進行單酶切，進行純化回收后，與擴增的反向片段DDM1-2進行連接轉化，挑取單克隆進行測序驗證，同時用Hind Ⅲ和EcoRⅠ對構建好的重組質粒進行酶切驗證，能得到1760 bp大小的條帶，說明構建成草莓DDM1基因RNAi表達載體p35S-FveDDM1-RNAi。將測序完全正確的重組質粒利用凍融法[21]轉入農桿菌EHA105感受態細胞，保存陽性克隆供草莓的遺傳轉化使用。

1.2.4 草莓外植體的制備

取適量飽滿的二倍體草莓的種子通過消毒滅菌后接種于含MS固體培養基的組培瓶中，待長成小苗后，選取葉齡35 d左右、長勢一致、葉脈清晰、葉片厚實、葉色不深的嫩葉作為遺傳轉化的外植體。

1.2.5 農桿菌介導的森林草莓的遺傳轉化

在懸浮含有表達載體質粒的農桿菌菌液的同時，把選作外植體的草莓葉片在背面用刀片沿垂直葉脈方向輕輕劃三刀或四刀。將切好的葉片置于復蘇好的菌液中，置于28 ℃搖床100 r/min浸染20 min。將浸染好的葉片的正面貼于共培養培養基(MS-B5+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA+100 μmol/L AS)上，黑暗培養3 d后，轉入脫菌培養基(MS-B5+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti)中，在弱光下培養15 d左右，觀察葉片是否長出愈傷，未長出愈傷的繼續脫菌，長出愈傷的外植體移至含有抗生素的篩選培養基(MS-B5+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)上在光下進行篩選培養，培養室溫度為22 ℃，為了防止葉片褐化，每2周更換1次培養基。

當有不定芽產生時，將不定芽進行分離。先轉移至生芽培養基(MS-B5+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)中培養，待長出葉后將其轉入到生根培養基(MS-B5+0.2 mg/L IBA +300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)中，待長成完整小苗，有3～5片真葉時，緩苗后移入花盆中。

1.2.6 GUS染色

對轉基因草莓葉片進行GUS染色檢測，剪取轉基因草莓幼葉進行GUS染色，以野生型草莓植株作為對照。37 ℃保溫過夜后，用無水乙醇進行脫色，直到所取葉片的表面呈無色，顯微鏡或肉眼可以觀察到葉片邊緣組織有明顯的藍色，則表明GUS報告基因已整合到草莓基因組中，并發生了表達。

1.2.7 實時熒光定量PCR

采用RT-qPCR方法，對轉基因草莓DDM1基因表達量進行分析，驗證RNAi的干擾效率。選用森林草莓的GADPH基因作為內參基因。利用Primer Premier 5.0軟件設計RT-qPCR的檢測引物，其中FveDDM1基因上、下游引物序列分別為：FveDDM1-F/FveDDM1-R(見表1)。實驗所得數據經過軟件輸出后采用 Microsoft Excel和SPSS對數據進行作圖分析，運用△△CT法對基因的相對表達量進行計算。所有樣品均設置3次獨立生物學重復。

2 結果與分析

2.1 森林草莓FveDDM1基因正向片段DDM1-1擴增

為了構建FveDDM1基因干涉表達載體，以森林草莓的cDNA為模板，選擇DDM1基因(GenBank登錄號：XM_004289096)上392 bp的片段進行PCR擴增，獲得了該基因的一段正向片段(DDM1-1)，通過電泳分析，結果顯示所獲得的目的片段的大小和預期一致(圖 1-A)。

圖 1 正向片段DDM1-1擴增(A)和p35S-DDM1-1-RNAi質粒PCR檢測(B)

2.2 中間載體的構建

將擴增的正向片段和用SalⅠ單酶切的骨架載體進行連接后，將連接產物進行大腸桿菌DH5α的轉化，涂板經抗性篩選后，挑取單菌落進行培養，然后進行菌落PCR驗證，經電泳檢測后能擴增出600 bp與目的片段大小一致的條帶(圖 1-B)，說明目的片段可能連接到骨架載體上面。將陽性重組質粒送南京金斯瑞測序，結果表明已成功構建p35S-DDM1-1-RNAi中間載體，保存測序正確的重組質粒用于后續實驗。

2.3 FveDDM1基因反向片段DDM1-2擴增和干涉載體的構建

以測序正確的重組質粒為模板，利用反向引物F2和R2進行擴增得到反向片段DDM1-2(圖 2-A)，然后與用XbaⅠ單酶切的中間載體進行一步克隆連接，再將其轉入大腸桿菌感受態中，進行Kan抗性篩選后，挑取單菌落進行培養，然后進行重組質粒的提取，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切檢測結果顯示片段大小與預期的大小一致(1760 bp)，見圖 2-B。將陽性克隆進行進一步的測序檢測，結果顯示已成功的構建成FveDDM1基因的干涉表達載體，載體結構如圖 3所示。將測序結果完全正確的pFveDDM1-RNAi質粒轉入農桿菌后，用做森林草莓的遺傳轉化。

2.4 轉基因草莓株系GUS染色鑒定

依據Jefferson等[22]的染色方法，對轉基因草莓株系進行GUS染色檢測。分別剪取生長在MS培養基上的野生型和轉基因型的草莓葉片進行GUS染色，通過脫色可以觀察到野生型植株的葉片呈現白色。相比之下，轉基因草莓葉片呈現藍色(圖 4)，表明GUS基因已經插入到草莓的基因組中，并且進行了表達，說明了草莓轉化成功。

M：DNA Marker DS2000。 A圖1和2：反向片段DDM1-2 ；B圖1、2和3：pFveDDM1-RNAi質粒經Hind III和EcoR I酶切結果

圖3 pFveDDM1-RNAi載體結構簡圖

CK：對照(野生型)；1～7：不同轉基因株系

2.5 轉基因草莓中甲基化修飾基因FveDDM1的表達分析

WT：野生型；R1～R4，R6～R7，R9～R11：不同轉基因株系。柱狀圖中字母不同代表顯著差異(P≤0.01)

為了進一步驗證RNAi的干擾效果，利用RT-qPCR對草莓轉基因株系的DDM1基因進行表達分析。結果表示，與野生型相比，轉基因草莓不同株系中FveDDM1基因的相對表達出現了顯著的下調(P≤0.01)(圖5)。

2.6 轉基因草莓的表型分析

經過農桿菌浸染、共培養、脫菌、篩選及生根培養等過程，得到了50個獨立株系的FveDDM1的RNAi轉基因材料，并且已觀察到了相應的表型，FveDDM1沉默植株葉片出現了明顯的畸形，葉邊緣變窄，缺刻變深(圖6)，各個RNAi株系果實的表型正在觀察中。以上現象表明DNA甲基化對草莓的生長發育具有重要的調控作用。

WT：野生型；FveDDM1：RNAi的轉基因草莓

3 討論與結論

近年來，RNA干擾技術發展迅速，由于其能特異并高效的抑制特定基因的正常表達，降低目的基因的表達量，同時還可以進行多代穩定遺傳，因此逐漸成為植物基因功能研究的重要遺傳學手段[23]。而RNAi技術的關鍵在于選擇目標基因構建高效的RNA干擾表達載體。之前的研究表明，所用的基因RNAi片段在98到853 bp時都能對基因的表達起到很好的抑制效果(抑制效率可達到90%)[24-25]。Wlesley等[26]發現在目的基因的正向片段和反向片段之間插入一個內含子，可以顯著提高正義鏈和反義鏈RNA形成雙鏈RNA的效率，有利于產生siRNA。在本研究中為了獲得較好的干涉效果，所使用的載體在啟動子下游的多克隆位點中間包含一個128 bp的內含子，這與胡旭霞和劉耀光[27]在水稻基因RNA干涉載體的設計一致，同時我們所用的RNAi片段長度為392 bp。因此，本研究在進行載體構建時采用了較為理想的實驗方案。

先前的研究表明，DNA甲基化對植物形態的建成和發生有很大影響，甲基化的缺失去引起植物一系列異常的表型[3-4]。依據轉錄組數據，FveDDM1基因在草莓葉片上具有較高的表達[28]，表明該基因對草莓葉片的生長發育可能起著重要作用。本研究中我們通過構建FveDDM1基因的沉默載體，來降低FveDDM1的表達。結果發現FveDDM1-RNAi的轉基因株系，FveDDM1基因在草莓葉片中的表達量明顯降低，并且草莓葉片出現了明顯的異常表型，比如葉邊緣變窄，缺刻變深。因此，我們推測FveDDM1甲基化基因在維持草莓葉片的正常形態中起著重要作用。