解淀粉芽孢桿菌TF28不同施用方式對棚室連作黃瓜根際土壤細菌多樣性的影響

胡基華 李晶 曹旭 姜威 陳靜宇 孟利強 張淑梅

摘要：為了研究棚室黃瓜連作障礙，利用微生物菌劑改善連作產生的土壤問題，將解淀粉芽孢桿菌TF28以液體（L）、顆粒（P）、復合（LP）3種形式施用，取苗期、花期、盛果期、結果后期土壤樣品，采用高通量測序技術對施用TF28與不施用TF28（CK）處理的土壤細菌多樣性、群落組成進行比較分析，并對菌群代謝功能進行預測。結果顯示，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）為8個優勢菌門。Haliangium、Asanoa、Microvirga 3個屬與CK差異明顯。結果3種處理的菌群功能預測結果比CK好，其中P處理預測結果比其他2種處理好，對棚室連作黃瓜土壤調節穩定。本研究為改善棚室連作黃瓜障礙，實現設施蔬菜持續穩定健康生產提供理論依據。

關鍵詞：高通量測序;連作障礙;細菌豐度;代謝功能;施用方式

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0262-07

收稿日期：2019-11-14

基金項目：黑龍江省院所基本應用技術研究專項（編號：ZNBZ2018SW02）。

作者簡介：胡基華（1970—），女，吉林長春人，博士，副研究員，主要從事生物防治方面研究。E-mail：158631375@qq.com。

通信作者：張淑梅，博士，研究員，從事微生物藥物研究。E-mail：shumeizhang@Yahoo.com。

連作障礙備受關注[1]，研究表明土壤微生物區系改變是造成作物連作障礙的重要因素之一[2]。在東北地區，黃瓜（Cucumis sativas L.）是設施蔬菜的主要栽培種類，1年可多茬栽種，農民為了經濟效益盲目增加肥料投放量，更加劇了土壤營養失衡。土壤產出率雖高，但得不到修復、連年惡化，隨著時間積累作物生理病害日益嚴重，產量和品質也隨之下降[3-5]。土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，可以提高土壤肥力、維持土壤生態系統物質的良性循環，一定程度上抑制作物土傳病害[6]。微生物群落結構越豐富，多樣性越高，對抗病原菌的綜合能力越強[7]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布廣泛，是一類重要的生防資源菌，具有較高開發價值[8-9]，在植物病害生物防治方面具有廣闊的應用前景[10]。內生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28是從大豆根部分離出的1株內生細菌，具有廣譜抗菌活性[11]。前期研究發現，它可以改善棚室連作土壤的pH值，增加土壤細菌、放線菌生物量，降低真菌生物量，同時對磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶具有調節作用;對黃瓜的根系發育具有促進作用[12]。本研究基于前期試驗結果，選取苗期、花期、結果期和結果后期土壤樣品，采用高通量測序技術，對棚室連作黃瓜根跡土壤細菌群落豐度動態變化和菌群功能進行研究預測，以期為微生物改善連作障礙、改良土壤健康狀況提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗所用菌株由黑龍江省科學院微生物研究所生物工程重點實驗室分離保存。試驗地點：黑龍江省哈爾濱市太平鎮興業村。2018年2月穴盤育苗，4月5日棚室移載;菌液濃度為108 CFU/mL，顆粒劑含菌量為2×108～3×108 CFU/g。菌劑施用方法：（1）液體樣品（L）施用法：移栽時在苗根部澆施 5 mL（108 CFU/mL）/顆;（2）顆粒劑（P）施用法，瓜苗移栽前穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/顆;（3）復合[LP（菌液+顆粒劑）]施用法：移栽時穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/顆，移栽后澆施菌懸液 5 mL（108 CFU/mL）/顆。以不施用TF28的處理為空白對照（CK）。日光溫度南北跨度50 m，東西跨度 7 m，黃瓜種植行距50 cm，株距35 cm。按周取樣，采用五點取樣法取根際5～10 cm處土壤，混合過 2 mm 篩，于-80 ℃凍存備用。

1.2?土壤微生物基因組DNA提取

根據前期TF28對黃瓜的生育指標、pH值、酶（磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶）活性的試驗結果[12]，選用苗期（第2～3周）、花期（第4周）、盛果期（第6～7周）、結果后期（第10周）6個時間段的24組樣品，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行DNA提取和高通量測序。使用OMEGA土壤試劑盒（D5625-01）提取細菌總基因組DNA樣本，-20 ℃ 存儲。分別用NanoDrop ND-1000分光光度計（美國賽默飛世爾科技有限公司生產）和瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA的提取量和質量。

1.3?聚合酶鏈式反應（PCR）擴增及高能量測序

提取的DNA以v3和v4為目標區域進行PCR擴增，引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）及806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），擴增產物在Illumina Miseq平臺上進行高能量測序。

1.4?對根際土壤細菌群落的分析

對Illumina Miseq測序平臺所得數據進行處理，去除低質量序列（長度<150 bp、測序堿基質量值<20的序列，即模糊堿基和單核苷酸重復>8 bp 的序列），得到優質序列進行下游分析。在嵌合體檢測之后采用UCLUST軟件以97%相似度進行操作分類單元（OTU）劃分，按豐度高低使用QIIME軟件構建稀釋性曲線。通過Galaxy在線分析平臺進行LEfSe分析，對樣本（組）間進行分類學組成的差異分析。使用Mothur軟件，調用Metastats（http：//metastats.cbcb.umd.edu/）的統計學算法，對門、屬水平的各分類單元在樣本（組）間的序列量（即絕對豐度）差異進行兩兩比較。菌群代謝功能使用PICRUST預測工具，將現有的16S rRNA基因測序數據與代謝功能已知的微生物參考基因組數據庫相對比，從而實現對細菌和古菌代謝功能的預測，根據不同物種16S rRNA基因拷貝數的差異，對原始數據中的物種豐度數據進行校正。

1.5?數據分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據分析，應用ANOVA單因素（LSD法）進行顯著性檢驗（P<0.05）。

2?結果與分析

2.1?不同處理土壤微生物群落豐度及多樣性

3種處理6個時間點共計24個樣本，共獲得804 159條高質量的內轉錄間隔區（ITS）序列。土壤細菌覆蓋度（coverage）指數為0.909 8～1.000，測序數據量合理，測序數據基本涵蓋棚室連作黃瓜土壤中所有細菌類群，能體現土壤環境中細菌特征。按97%的序列相似度進行歸并共產生10 398個OTU，L、P、LP和CK所特有的OTU數量分別為679、773、717、713（圖1-a）。多樣性Simpson和Shannon指數第4周P處理均為最高，分別為 0998 619 和10.50（表1）;豐富度Chao1和ACE指數在第6周P處理有最高值，分別為4 043.64和 4 172.24;可視物種在第2周LP處理顯示為最高值3 044.00。

2.2?不同處理棚室連作黃瓜土壤細菌群落組成

根據獲得的OTU豐度矩陣，使用R軟件計算各樣本（組）獨有及共有OTU數量，L、P、LP和CK的OTU分別為679、773、717和713（圖1-a）。OTU共注釋到31個門，106個綱，218個目，424科，1 008個屬和1 769個種。門水平豐度前20用柱形標示（圖1-b），其中大于1%的有8個，分別是變形菌門（Proteobacteria，43.52%）、放線菌門（Actinobacteria，25.80%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，7.19%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，7.00%）、綠彎菌門（Chloroflexi，632%）、酸桿菌門（Acidobacteria，438%）、厚壁菌門（Firmicutes，1.89%）、螺旋體菌門（Saccharibacteria，1.85%），變形菌門為主要優勢菌類群。1 008個屬豐度高于1%有17個，其中4個為變形菌門，3個為放線菌門、綠彎菌門和擬桿菌門，芽單胞菌門、放線菌門、螺旋體菌門和厚壁菌門各有1個。

2.3?不同處理樣本間差異分析

表2顯示，門水平兩兩比較發現P-CK中綠菌門（Chlorobi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門這5個具有差異性;L和CK兩兩比較中酸桿菌門具有差異性（表3）。屬水平比較中，P和CK具有差異性的樣本（組）共有44個（表2、表4），L和CK有28個，LP和CK有15個。屬水平樣本（組）間差異最顯著的前20個分類單元的豐度分布情況用小提琴圖標示（圖2），其中Asanoa、Georgenia、Microvirga的3個處理與CK差異最為明顯。

2.4?菌群代謝功能預測

根據PICRUST預測結果，共有功能類群數量為5 757（圖3-a）;兩兩重疊部分數量分別是3（L/CK）、6（L/LP）、8（LP/P）、14（L/P）、7（P/CK）、7（LP/CK）;三重疊部分數量分別為12（CK/L/LP）、44（L/LP/P）、7（CK/L/P）;L、LP、P和CK獨有功能菌群數量分別是21、58、16和5。如高豐度前50位的功能類群聚類分析繪制熱圖（圖3-b）所示，將兩大區塊按豐度高低再分為4個區塊（圖3-b黃線分割）。在10個高豐度功能類群中，3個處理組各有3個，CK有1個;在14個低豐度樣品中，3個處理組各有3個，CK有5個。P處理6個時間段分別在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區，4個區均有L、LP處理。部分類群功能見表5。

3?討論與結論

微生物在土壤有機質形成和養分轉化循環中有重要作用[13]，土壤微生物群落結構、多樣性、活性是影響連作障礙的主要因素[14]，同時也是維持土壤生態系統穩定性和可持續性的重要保證。設施蔬菜連作會導致土壤微生物群落結構單一、有害微生物數量增多[15]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28能夠產生多種抗菌物質，具有廣譜抑制植物病原真菌的功能[16]。本研究結果顯示，3種處理在苗期、花期、盛果期、結果后期土壤微生物的群落結構差異不大，連作并未造成土壤菌群生物量大量減少，菌群構成較穩定。但是在花期、盛果期，土壤微生物相對豐度存在較大差異，這與前人研究結果[17-19]相似。P處理在第4周（花期）和第6周（盛果期）多樣性指數與豐富度指數達到最高值，明顯高于其他2種處理和空白對照，根際微生物主要類群的數量與其生長發育呈正相關關系，這與前人研究結果[20]一致。土壤細菌群落組成結果表明，變形菌門為優勢類群、其次為放線菌門和芽單胞菌門，連作會造成土壤微生物選擇性的適應，造成某些種群富集，而另一些種群數量降低的現象[17]。與CK相比，P處理提高硝化螺旋菌門微生物量，硝化螺旋菌門具有固氮作用和良好的根際效應，相關結論有待后續試驗驗證。酸桿菌門是L和P處理與CK共同差異菌門，特別是P處理酸桿菌門OTU相對豐度比CK提高60.4%，顯示了明顯的調節作用;已有的研究表明酸桿菌廣泛存在于自然界的各種環境中，占土壤細菌類群的5%～46%或者超過50%[21-22]，大多為嗜酸菌，對土壤pH值極為敏感[23]。3種處理對Haliangium、Acidibacter、Microvirga具有明顯的調節作用（表4、圖3），Haliangium為一種中度嗜鹽菌群[24]，Acidibacter為一種嗜酸鐵離子還原菌[25]，Microvirga具有明顯的溶大腸桿菌活性，抑制馬鈴薯晚疫病菌活性[26]。菌群代謝功能預測L、LP、P特有數量均比CK高;三重疊部分數量CK與L、LP組和L、P組數量分別是12和7，而L、LP、P重疊部分數量為44，差異明顯，2組數據說明3種處理與空白對照相似度小，對土壤微生物的功能作用高于空白對照。LP2、L10、CK10 3個時間段在Ⅰ區功能類群豐度值相對較高，這可能是苗期土壤微生物代謝功能健康，結果后期植株需要養分較少，同時土壤具有自我修復能力的表現。菌群代謝功能結果顯示，TF28提高了連作土壤整體細菌群系的功能包括生物降解和代謝、類萜化合物和聚脂化合物的代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、多糖和單糖生物合成和代謝等，代謝功能作用將在后續工作中繼續研究證實。

本研究結果說明，解淀粉芽孢桿菌TF28對棚室連作黃瓜根際土壤具有改善作用，3種處理對土壤微生物細菌群落豐度及多樣性與CK無明顯差異，對連作黃瓜土壤中細菌群落組成與CK差異明顯。TF28對棚室連作黃瓜土壤具有一定的調節修復作用，P處理與L和LP相比表現出良好的根際效應和穩定的改善作用。

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