一種酸棗仁提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸配方產品改善睡眠作用研究

陳希民,王 鑫,魏九齡,陳月曉,馬姍婕,何 梅,李 東

(北京市營養源研究所,北京 100069)

睡眠障礙是由于睡眠的解剖部位發生病變或生理功能紊亂引起睡眠質量的異?；蛟谒邥r伴隨某些臨床癥狀,是睡眠和覺醒正常節律性交替紊亂的表現[1]。資料表明[2],兒童睡眠障礙發生率為10%～45%,青春期為11%～30%。2004～2013年間,中國0～12歲兒童睡眠障礙合并報告率為35.1%。我國老年人睡眠障礙發生率較高,約為20%～60%,且隨著年齡增加,呈不斷上升的趨勢[3]。

酸棗仁中化學成分主要包括皂苷、三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿類化合物,是臨床上中醫藥治療失眠癥狀的首選藥物[4],但實際應用中劑量浮動較大[5-10],效果也存在差異[11]。既往研究表明酸棗仁可延長果蠅睡眠總時間,同時片段化睡眠增強[12],并可顯著增加小鼠總睡眠和REM時間[13]。茶氨酸是茶葉中含有的一種特殊的非蛋白質氨基酸,有著顯著的抗焦慮作用,可顯著提高大鼠腦組織中單胺類神經遞質的濃度。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種抑制性神經遞質起到分子信號的作用,對癲癇、驚厥、帕金森病等多種精神疾病具有一定的療效。我國在2009年和2014年分別GABA和茶氨酸列入新食品原料[14-15]。酸棗仁、茶氨酸和GABA單獨使用均具有一定的改善睡眠作用,三者聯合使用效果未見報道。

因此,本文以小鼠為動物模型,旨在探索酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復合配方的調節睡眠作用,為酸棗仁、茶氨酸和GABA的有效利用及改善睡眠保健產品的研發提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級Balb-c健康雄性小鼠 180只,8周齡,18～20 g,南京市江寧區青龍山動物繁殖場;許可證號:SCXK(蘇)2017-0001);酸棗仁提取物、茶葉茶氨酸、GABA 北京市營養源研究所提供;戊巴比妥鈉(純度>99%)、巴比妥鈉(>99%) Sigma公司提供;蒸餾水 廣東去城市食品飲料有限公司提供。

XS1003S型電子天平 瑞典Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養與分組 SPF級Balb-c健康雄性小鼠180只飼養于東南大學動物實驗室,室溫(25±2) ℃,相對濕度55%±2%,12 h/12 h光照/黑暗,自由攝食和飲水。按體重分為3組,每組60只。各組件體質量無統計學差異。其中第1組進行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗;第2組進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗;第3組進行巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗;以上實驗同時進行直接睡眠實驗。因鼠類活動夜間比白天活躍,因此動物干預及實驗開展均在夜間8點開展,消除動物活動狀態變化對實驗影響。

1.2.2 劑量設置 參考酸棗仁、茶氨酸、GABA文獻資料中單獨使用劑量[16-18],將復合配方人體每日攝入量設定569 mg/d(折算9.48 mg/kg·bw),其中為酸棗仁5.25 mg/kg·bw,(相當于原藥材52.50 mg/kg·bw)、茶葉茶氨酸2.9 mg/kg·bw、GABA 1.33 mg/kg·bw。

復合配方以每日95、190、285 mg/kg·bw 3個劑量給予動物,分別相當于受試物人體攝入量的10、20、30倍。另設置蒸餾水作為對照組樣品。受試物每日蒸餾水配制,每日灌胃。

1.2.3 動物干預 每組實驗60只小鼠,適應性喂養3 d后,實驗前,稱量小鼠初始體重,并根據小鼠體重分為4組,分別是空白對照組(蒸餾水,20 mL/kg·bw)、低劑量組(95 mg/kg·bw)、中劑量組(190 mg/kg·bw)、高劑量組(285 mg/kg·bw),每組15只。各組動物每天灌胃1次,持續灌胃干預30 d。每周測量一次小鼠體重,調整灌胃劑量。

1.2.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 參考《保健食品檢驗與評價技術規范》[19],動物末次灌胃給予樣品30 min后,各組小鼠腹腔注射50 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.)(小鼠100%入睡劑量,前期試驗已驗證),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標準,以小鼠翻正反射消失到恢復這段時間為動物睡眠時間,比較受試物是否延長戊巴比妥鈉注射小鼠的睡眠時間。

1.2.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 參考《保健食品檢驗與評價技術規范》[19],動物末次灌胃給予樣品30 min后,各組小鼠腹腔注射30 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.)(小鼠10%～20%入睡劑量的閾下劑量),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標準,記錄30 min內各組入睡動物數并計算睡眠發生率。睡眠發生率(%)=(入睡動物數/每組動物數)×100。比較受試物是否增加閾下劑量戊巴比妥鈉注射小鼠的睡眠發生率。

1.2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗 參考《保健食品檢驗與評價技術規范》[19],動物末次灌胃給予樣品20 min后,各組小鼠腹腔注射280 mg/kg·bw巴比妥鈉(i.p.)(小鼠100%入睡劑量),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標準,以小鼠注射巴比妥鈉到翻正反射消失的時間作為睡眠潛伏期,比較受試物能否縮短巴比妥鈉注射小鼠的睡眠潛伏期。

1.2.7 直接睡眠試驗 各組動物每天給予受試物,觀察灌胃后1 h內,小鼠是否出現睡眠現象,以動物的翻正反射消失超過60 s判為進入睡眠,比較空白對照組和配方產品各劑量組對小鼠的直接催眠的影響。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 改善睡眠配方對小鼠體重的影響

對延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中實驗動物干預前后動物體重進行分析。由圖1可知,實驗前各組小鼠初始體重無明顯差異(P>0.05);灌胃給予不同劑量的配方7、14、21、30 d后,各組小鼠體重均無顯著性差異(P>0.05)。實驗期間各組小鼠皮毛有光澤,飲食和活動正常。給予樣品后,小鼠糞便濕潤程度適中,未見腹瀉和稀便等現象,表明配方產品在本試驗設計劑量下對小鼠體重未造成明顯影響。

圖1 配方對小鼠體重的影響

2.2 配方對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響

按照《保健食品檢驗與評價技術規范》[19],在戊巴比妥鈉催眠基礎上,若復合配方干預后小鼠睡眠時間延長,說明復合配方與戊巴比妥鈉有協同作用,結果見圖2,空白對照組小鼠睡眠時間為(33.87±4.98)min,復合配方低、中、高劑量組(95、190、285 mg/kg·bw)干預后睡眠時間為(38.79±4.40)、(39.67±4.10)、(41.93±5.44)min。與空白對照組比較,低、中、高劑量組小鼠睡眠時間分別延長14.53%、17.12%、23.80%,均具有統計學差異(P<0.01)。說明一定劑量的復合配方與戊巴比妥鈉具有協同作用,可以極顯著延長小鼠睡眠時間。

圖2 配方對戊巴比妥鈉處理的小鼠睡眠時間影響

2.3 配方對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

對復合配方進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗,研究其對小鼠睡眠發生率的影響,由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝,其誘導小鼠睡眠時間的長短反映了肝酶的活性[20],而對該酶有抑制作用的藥物,也能延長戊巴比妥鈉睡眠時間。為排除這種影響,將戊巴比妥鈉劑量降至閾下劑量,即10%～20%小鼠入睡的劑量,進行閾下劑量催眠實驗,結果見表1。

表1 小鼠戊巴比妥鈉注射后睡眠發生率比較

由實驗結果看出,空白對照組小鼠睡眠發生率為13.33%,符合本實驗10%～20%的動物入睡要求,說明30 mg/kg·bw可用于戊巴比妥鈉符合閾下劑量實驗。低、中、高劑量組的睡眠發生率分別為33.33%、53.33%和73.33%,均高于空白對照組的睡眠發生率,且隨著劑量增加,睡眠發生率逐漸增加。與空白對照組相比,低劑量組的睡眠發生率增加卻不具有顯著性差異(P>0.05),中、高劑量組睡眠發生率顯著增加(P<0.05,P<0.01),且具有劑量效應關系。以上結果表明,復合配方與戊巴比妥鈉的協同睡眠作用并非通過影響戊巴比妥鈉的代謝過程而實現的。

2.4 配方對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

睡眠潛伏期即小鼠注射巴比妥鈉至翻正反射消失之間的時間,睡眠潛伏期越短說明樣品促進睡眠效果越好。結果見圖3。巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中,復合配方低、中、高劑量組(95、190、285 mg/kg·bw)干預后,小鼠睡眠潛伏期分別為(44.87±4.08)、(38.87±8.46)、(38.93±6.01) min,與空白對照比較,低、中、高劑量組睡眠潛伏期時間分別縮短12.48%、24.19%、24.07%,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著劑量的增加,小鼠睡眠潛伏期也逐漸縮短,說明配方縮短小鼠睡眠潛伏期功效具有劑量-效應關系。實驗結果表明,復合配方促進小鼠入睡作用良好,隨著劑量增加,促進入睡效果呈增強趨勢,具有縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期的作用。

圖3 小鼠巴比妥鈉干預后睡眠潛伏期時間結果

2.5 直接睡眠實驗

通過30 d配方樣品干預觀察發現,低、中、高劑量組小鼠睡眠只數均為0只,說明配方無直接睡眠作用。

從戊巴比妥鈉誘導睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉催眠實驗及巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結果可以看出,酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復合配方與戊巴比妥鈉、巴比妥鈉均具有較好的協同作用,即能夠促進睡眠的發生,也有助于睡眠的維持。復合配方在95 mg/kg·bw劑量時延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結果陽性,此時,酸棗仁提取物、茶氨酸的劑量分別為52.29、29.05 mg/(kg·bw),當劑量提升至190及285 mg/(kg·bw)時,劑量亦遠低于單獨使用有效劑量[16-18],三種原料具有協同作用。出現協同作用的原因可能是a. 在成分上，酸棗仁和GABA均與谷氨酸代謝密切相關。劉靜等[21]對酸棗仁蛋白質含量和氨基酸組成進行綜合評價，結果表明酸棗仁蛋白質含量高達40%(干重)，其中18種常見氨基酸中，谷氨酸含量最高，占種氨基酸的30.95%；GABA是谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下形成的，屬于谷氨酸的結構類似物；在結構上，茶氨酸屬于酰胺類化合物，和GABA在結構也具有一定的相似性，從而導致其功能相近[22]。b. 在改善睡眠生理功能方面， 酸棗仁影響大腦皮質代謝性谷氨酸受體的表達,調節谷氨酸的釋放[23],促進GABA合成,抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸的過多活躍[24],同時可提高調節大鼠海馬中5-T1AR和5-HT2AR的表達[25],改善睡眠狀態;茶氨酸可促進大腦表面α波產生,使人體產生舒適愉悅的感覺;GABA在促進α波產生的同時抑制β波的產生,具有鎮靜大腦降低壓力的作用[26],三者在生理上具有協同效應[15]。

3 結論

本實驗研究通過延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗和直接睡眠實驗研究了酸棗仁提取物、茶氨酸。GABA復合配方的改善睡眠作用。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》[19],延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中兩個實驗結果陽性,即可判定受試物具有改善睡眠的功效。本研究顯示,復合配方具有改善睡眠功效且效果隨劑量增加而升高。

本次研究的主要依據為《保健食品檢驗與評價技術規范》,根據其實驗要求證實了酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復合配方具有改善睡眠的功效,指標檢測主要集中于動物行為學的觀察,三種原料復合使用在神經遞質、細胞因子、激素、肽類等方面的共同作用有待于進一步深入研究。