液相-質譜聯用法檢測食品中己烯雌酚的研究

彭婷婷 徐曉萍 朱曉蕾 董 耀

(江蘇省生產力促進中心，江蘇 南京 210042)

己烯雌酚為人工合成的非甾體類雌激素物質，能產生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用[1-5]，主要添加在飼料中,能引起人體內激素失調等疾病。研究發現,其在動物性產品中的殘留對人體健康和生態環境都會造成嚴重危害[6]。

雌酚在上世紀七八十年代作為類雌激素藥物廣泛用于口服避孕以及防止流產。它可以促使女性性器官及副性征正常發育，使子宮內膜增生以及陰道上皮角化，減輕婦女更年期或婦科手術后因性腺功能不足而產生的內分泌功能紊亂，增強子宮收縮，提高子宮對催產素的敏感性。己烯雌酚剛一問世就受到廣泛歡迎。許許多多的人不用再擔心孩子的出生，以及孩子的無法出生。然而，當時人們完全沒有認識到它的危害性，直至大量使用己烯雌酚的女性的孩子出生之后，問題來了，并且在孩子青春期之后更加集中表現出來。服用過己烯雌酚的人生下的女孩，其陰道和宮頸細胞都有不同程度的病變。研究表明，陰道透明細胞腺癌近幾年在少女和年輕婦女中的發病率有增加趨勢。據調查，這些病人在出生前就受到過己烯雌酚的影響。胎兒期接觸過己烯雌酚的婦女，24歲時患本病的累積危險性是0.14%～1.4%。還有相當多的人有子宮頸和陰道的良性組織改變，稱為腺瘤病。通過對胎兒期接觸過己烯雌酚婦女的常規檢查發現，約有1/3的人有上述異常。

在胎兒期接觸過己烯雌酚的男性中，生殖系統異常的發生率也很高。這些病人與相同年齡組、在胎兒期未接觸過已烯雌酚的人相比，睪丸異常的發生率有顯著增加。這些病例，我們稱之為“DES綜合癥”。同時，懷孕期間服用己烯雌酚還可造成胎兒畸形，使女性男性化、男性女性化，甚至引起腦積水、腦脊膜膨出等。同時，對孕婦還可能造成肝臟和腎臟的損害，使哮喘的發病率明顯上升，還可能促使膽汁中的膽固醇飽和而形成結石，誘發胰腺炎和血管栓塞性疾病。這時人們才發現，己烯雌酚是一種環境激素，與雌激素受體結合后會干擾人的內分泌，誘發生殖器病變與腫瘤。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

標準物質樣品:己烯雌酚(中國計量科學研究院)。

標準溶液:水；甲酸；甲醇(色譜純，Fisher scientific)。

1.2 主要儀器

LC-MS(CLARUS SQ 8，PekinElmer)。

1.3 樣品處理

將樣品制成均勻的顆粒，稱取2.0 g，精確至0.1 mg，置于50 mL帶磨口塞子的試管中，加入萃取劑甲醇。放入40 ℃超聲水浴儀中超聲萃取，萃取液經離心，過濾，定容至10 mL，過膜，作為待測樣。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：ELITE-5HT,15 cm×0.25 mm×0.10 μm；進樣口溫度35 ℃；載氣：氮氣，流量：1.2 mL/min；進樣量：10 μL；電離源：ESI；流動相：0.1%甲酸/乙腈=40/60；己烯雌酚母離子269.2，子離子135.2和107.2，碰撞能量分別為10 V和20 V。

2 結果與討論

2.1 超聲波萃取條件的優化

本文將標準物質己烯雌酚作為研究對象，在超聲波萃取中，通過分析該標準樣品，對萃取時間和溶劑量進行優化。

2.1.1 最佳萃取時間的選擇

為了得到樣品最佳萃取時間，選用甲醇作為萃取溶劑，溶劑量為10 mL，依次設定萃取時間7.5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min，結果見圖1?？芍?，樣品在萃取30 min之后，己烯雌酚的萃取率大于99%,且穩定，因此其最佳萃取時間為30 min。

圖1 超聲波萃取時間與萃取率的關系圖Fig.1 Relationship between extraction time and sample extraction rate

2.1.2 最佳溶劑量的選擇

溶劑量也是影響超聲波萃取效果的主要因素，根據2.1.1的結果，超聲萃取時間30 min，甲醇的用量為5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL，實驗結果如圖2。由圖可得，其最佳溶劑量為10～15 mL。

圖2 超聲波萃取溶劑量與萃取率的關系圖Fig.2 Relationship between extraction solvent content and sample extraction rate

2.2 方法的線性方程及相關系數

配制濃度為20,50,80，100,150,200 ng/mL的一系列己烯雌酚的標準溶液，在前述的儀器分析條件下進行標準曲線的繪制。如圖3所示，采用液質聯用的方法，其線性相關系數為0.999，可知標準工作曲線具有良好的線性。

圖3 己烯雌酚線性圖譜Fig.3 The linear graph of stilbestrol in LC-MS

2.3 實際樣品的檢測

2.3.1 回收率實驗

采用上述優化的參數條件對自備實際樣品進行前處理，最后對所得樣品進行LC-MS檢測，平行測定5次。采用標準加入法來考察本方法的準確性，如表1所示，回收率在96.0%～104.0%之間,RSD在2.10%～5.86%。

表1 樣品回收率Tab.1 sample recoveries

2.3.2 對照實驗

為了進一步驗證超聲波萃取/液相色譜質聯用儀分析方法的可行性，同時還采用了液相色譜法對上述實際樣品進行檢測，所測得結果平均值相近，RSD在1.0%～1.7%之間。結果如圖4、圖5和表2所示。

圖4 液相色譜法己烯雌酚色譜圖Fig.4 The chromatogram of stilbestrol in HPLC

圖5 液相色譜法己烯雌酚的線性圖Fig.5 The linear graph of stilbestrol in HPLC

表2 參照實驗Tab.2 controlled experiment.

3 結論

本文以超聲波萃取技術對動物源性食品進行樣品處理，采用液相色譜—質譜法對己烯雌酚的含量進行測定。該方法簡便，高效，重復性好，回收率高。并和液相色譜法進行對照實驗比較，證明了該方法的可行性。