礦源黃腐酸與生化黃腐酸熱裂解組分的對比研究

王 智 張惠芬 秦 誼 李寶才 張 敉

昆明理工大學生命科學與技術學院 昆明 650500

黃腐酸是腐植酸類物質的三大組分之一[1～3]，具有活性官能團多、水溶性較好等優點。研究表明，黃腐酸生物功能眾多，如降低小麥對重金屬元素鉻的吸收，促進豆類植物運輸磷酸鹽和鐵離子，促進鹽脅迫條件下樹木、小麥、煙草的生長[4～7]。實踐證明，黃腐酸在改良土壤、提高化肥利用率、提高作物抗逆性等方面有穩定可靠的效果[8～10]。除了農業上的應用，黃腐酸也在醫藥、環境、畜牧業等領域中廣泛應用[11～13]。目前，關于黃腐酸的研究主要集中于其化學組成與功能評價。其中，化學組成是基礎和關鍵，直接影響著活性機制的闡明與黃腐酸系列產品的深度開發。

熱裂解是在急劇升溫的條件下，將大分子樣品裂解成小分子碎片后進行分析的方法[14]。將其與氣相-質譜分析方法串聯使用，可有效探究碎片化后揮發性小分子的化學結構，從而提供成分組成信息及被分析大分子的物質組成特征等。Stefanova等[15]通過對歐洲褐煤腐植酸的還原熱解分析，推測組成腐植酸的基本結構單元是含有雜原子的1 ～2 個芳香稠環。Schellekens 等[16]使用熱裂解-氣相色譜-質譜（Py-GC-MS）法，比較了不同來源腐植酸及黃腐酸的分子結構、化學組成，分析樣本來源比較全面，包括了礦物、土壤、河流等。結果顯示：熱裂解的主要產物為碳水化合物、酚類、苯、木質素酚類化合物，占所有定量熱解產物的62%～96%。因此分析表明，黃腐酸的芳香程度不如腐植酸整體的芳香程度高。Baigorri 等[17]利用熱裂解分析發現：與其他腐植酸類物質相比，土壤和褐煤中的黃腐酸包含芳香族結構更小且含氧基團更多的結構單元。

工業化生產方面，礦源黃腐酸的主要原料為泥炭、褐煤和風化煤[18～20]，而生化黃腐酸主要利用微生物發酵從植物廢料中提取。由于礦物和植物差別巨大，而礦物本身也因成煤時間、成煤植物、礦區環境等各種因素導致成分迥異。因此，即便制備方法相同，來源不同也會造成黃腐酸的物質組成產生差異[21，22]。為進一步對比研究不同制備原料對黃腐酸物質組成的影響，本研究采用Py-GC-MS法分別對從不同產地的泥炭、褐煤和風化煤中提取的黃腐酸進行了熱裂解產物分析，同時對比了生化黃腐酸的熱裂解組分，以期為礦源黃腐酸化學研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

提取礦源黃腐酸所用的泥炭、褐煤和風化煤分別來源于云南會澤、峨山，黑龍江寶清以及新疆托克遜地區煤礦。具體采樣地點和原料種類見表1。

生化黃腐酸（甘蔗糖蜜提煉后液體發酵液，發酵程度不詳）購自廣西淼鼎生物科技有限公司。

表1 煤源地理位置Tab.1 The location of the coals

1.2 礦源黃腐酸的制備

利用過氧化氫氧化法分別從以上煤樣中提取黃腐酸，具體過程見Qin 等[9]的方法。

1.3 實驗儀器

熱裂解儀（CDS5000，美國），分析天平（AB204-S，METTLER-TOLEDO 瑞 士， 精 度0.1 mg），熱裂解裝置專用石英管（CDS，美國），固相微萃取頭（75 μm Carboxen-PDMS，Supelco，美國），氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀（6890A/5973C，Agilent，美國），HP-5MS色譜（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美國）。

色譜條件：進樣口溫度，280 ℃；載氣，He；流速，1.0 mL/min；分流比，10 ∶1；升溫程序，50 ℃（2 min）-10 ℃/min-140 ℃（1 min）-10 ℃/min-280 ℃（1 min）。

質譜條件：GC-MS 接口溫度，280 ℃；離子源，EI 源；電子能量，70 eV；掃描范圍，29 ～500 道爾頓；標準圖譜庫，NIST-14。

裂解溫度：600 ℃下熱裂解；裂解時間：10 s；裂解氛圍：氮氣。

1.4 實驗方法

分別稱取約5 mg 礦源黃腐酸或生化黃腐酸加入到裂解石英管中間位置，然后將石英管裝入熱裂解儀，分別在氮氣氛圍中的600 ℃下進行熱裂解，熱裂解產物用裂解瓶收集。熱裂解完成后將固相微萃取頭置于裂解瓶中對熱裂解產物進行萃取，萃取時間為30 min，萃取溫度為80 ℃。然后將固相微萃取進樣針插入氣相色譜的進樣口中進行解吸附，時間為2 min。熱裂解產物進入GC-MS 聯用儀進行分離與鑒定，并根據色譜峰面積，對鑒定物質的相對含量進行了分析。

1.5 數據處理

礦源黃腐酸與生化黃腐酸的總離子流色譜圖是色譜-質譜法測得的各種質荷比的離子總數隨時間變化的曲線。通過Data Analysis 軟件將色譜峰自動積分，通過NIST-14 標準圖譜庫對每個色譜峰的質譜圖進行檢索，鑒定黃腐酸的熱裂解產物，并對匹配度大于80%且相對含量較多的熱裂解產物列表。

2 結果與分析

圖1 ～圖5 為不同礦源黃腐酸與生化黃腐酸的Py-GC-MS 圖，表2 為不同來源黃腐酸匹配度大于80%且相對含量較多的熱裂解產物。我們通過預實驗發現：與300、500、700 ℃相比，600 ℃下的熱裂解產物能給出較多的碎片信息，且重排產物較少。因此，本實驗的熱裂解溫度為600 ℃。結合圖1 ～圖5 及表2，礦源及生化黃腐酸的熱裂解產物隨保留時間增加呈現出簡單到復雜的趨勢，結構類型依次為醛酮、苯環或雜環、稠環化合物。礦源黃腐酸的熱裂解組分保留時間大部分小于15 min。

所鑒定的會澤、寶清、峨山、托克遜礦源提取的黃腐酸及生化黃腐酸的熱裂解產物（表2）占總熱裂解產物的39.7%、41.3%、33.6%、34.8%及21.4%，相對含量較高的物質分別是糠醛、乙酸、乙酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。礦源黃腐酸的熱裂解產物主要有乙酸、苯、吡咯、甲苯、糠醛、苯酚、苯并呋喃、丁二酰亞胺、鄰苯二甲酸二異丁酯等物質；礦源產地不同，所提取的黃腐酸的熱裂解產物也大不相同，以糠醛為例，其在會澤泥炭、寶清褐煤、峨山褐煤、托克遜風化煤提取的黃腐酸中含量分別為8.509%、1.989%、6.819%、0。

圖1 會澤泥炭中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.1 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from peat in Huize

圖2 寶清褐煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.2 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Baoqing

圖3 峨山褐煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.3 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Eshan

圖4 托克遜風化煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.4 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from weathered coal in Tuokexun

圖5 生化黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.5 Py-GC-MS diagram of biodegradable fulvic acid

表2 不同來源黃腐酸的熱裂解產物Tab.2 Pyrolytic compounds of fulvic acid from different sources

表2 續

礦源黃腐酸及生化黃腐酸的共有物質是吡咯及苯酚。與礦源黃腐酸相比，生化黃腐酸的熱裂解產物中稠環芳香族化合物的含量較高。表2 中生化黃腐酸熱裂解產物除2-丁烯醛（E）、吡咯、糠醛、苯酚、對甲酚、丁二酰亞胺外，其余物質都是礦源黃腐酸所沒有的，并且都是稠環芳香性化合物。

3 結論與討論

本實驗使用固相微萃取裝置將裂解氣收集，通過GC-MS 聯用儀對熱裂解產物進行半定量分析。由于大分子化學鍵斷裂生成的小分子結構不穩定，在斷裂的時候某些小分子可能進行了重排。因此，熱裂解檢測到的化合物不一定是原本黃腐酸大分子中存在的分子片段。高溫下小分子含氧化合物可以生成烯烴、酸酐或酯，共軛二烯烴與不飽和化合物可發生1，4-加成反應，生成環狀化合物。多數熱裂解產物難以發生環加成反應，熱裂解產物中的芳香化合物可能多數是原本大分子中固有的。由于黃腐酸組成物質的分子量分布廣泛，結構復雜，而所需能量相差不大的化學鍵斷裂可能是隨機的，因此相同種類化合物的結構取代基也有許多差異，這些化合物有可能是相似的結構碎片重排產生的。

運用Py-GC-MS 法，能夠通過解析熱裂解組分而得到黃腐酸組成物質的分子片段信息。González-Pérez Martha 等[23]通過對土壤中的腐植酸熱裂解的特征分析，發現其組成受到土壤中原來的植物組成的影響。本研究中，600 ℃下礦源黃腐酸的熱裂解產物主要是脂肪族化合物以及單環芳香化合物，推測黃腐酸本身物質組成結構中應該含有芳香苯環或雜環結構片段，而這些芳香片段之間可能通過脂肪族碳鏈連接，而芳香苯環或雜環以及脂肪鏈上應分布有羰基、羥基、羧基、醛基、氨基等官能團。不同礦源的黃腐酸熱裂解產物差異明顯，而礦物來源與生化來源的黃腐酸差異更是顯著。與礦源黃腐酸相比，生化黃腐酸的熱裂解產物中含氧脂肪族化合物含量較低，而稠環芳香族化合物的含量較高。

生化黃腐酸是應用現代生物技術，以植物殘渣為原料，經生物發酵制取的黃腐酸類物質。它的性能與礦源黃腐酸類似，價格卻較低。原料不同必然造成礦源黃腐酸與生化黃腐酸的化學組成差異。黃腐酸的物質組成是黃腐酸發揮不同功能的基礎。根據熱裂解組分比較結果，說明了黃腐酸的物質組成受到原料及產地的極大影響而出現顯著差異。因此，無論是黃腐酸的物質組成，還是功能研究中，原料及產地都是產品研究中的重要考察環節及因素。