牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣的結構表征及特性研究?

王 真， 姜歲歲， 張 帆， 王潤芳， 馮 雪， 汪 瑞， 李詩洋， 趙元暉

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

牡蠣(Crassostreagigas)作為第一批被衛生部批準的藥食同源食品，不僅其肉質味道鮮美，營養豐富，而且其殼也是重要的中藥材，具有重鎮安神、軟堅散結、潛陽補陰的功效[1]。中國的牡蠣產量居世界首位，2017年牡蠣的海水養殖產量達 487.94×104t，約占貝類養殖總產量的 34%，較 2016 年幅度增長 4.70%，伴隨而生的是大量的占牡蠣整體質量60%以上的牡蠣殼[2-3]。除了部分用作藥材和土壤改良劑以及用于石灰生產外，大多數牡蠣殼被填埋、堆肥和向海洋傾倒等，引起很多環境問題。因此，如何把廢棄牡蠣殼資源化，備受國內外研究者關注[4]。

牡蠣殼中含有大量的碳酸鈣，質量分數占90%以上[5]。近年來不少學者研究利用廢棄牡蠣殼制備各種鈣制劑，為牡蠣殼的高值化利用提供了一些新的途徑[6-8]。目前，對于氨基酸螯合鈣的結構和理化特性研究不多，大部分僅局限于螯合物的制備，紅外和紫外分析等[9]。本試驗基于L-天冬氨酸(L-Aspartate, L-Asp)是酸性氨基酸，且作為鈣的載體及鈣結合蛋白的重要組成部分，能被細胞膜識別，通過特異性載體蛋白鈣通道在小腸絨毛膜上皮進行主動轉運吸收，可在加熱攪拌條件下直接與牡蠣殼粉反應生成L-天冬氨酸螯合鈣[8]，經過前期的螯合條件優化后，利用掃描電鏡、紅外光譜和質譜等對L-天冬氨酸螯合鈣進行結構表征，并研究其X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)、差示掃描量熱(Differential scanning calorimetry, DSC)、熱重(Thermogravimetry, TG)等指標及體外穩定性等特點，以期為深入開發和研究L-天冬氨酸螯合鈣提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

L-天冬氨酸螯合鈣(實驗室自制)；胃蛋白酶(3 000 U/g，索萊寶公司)；胰蛋白酶(50 kU/g，索萊寶公司)，溴化鉀(光譜純)和無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、二硫腙、茚三酮、硫化鈉(均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

YK高速萬能粉碎機 山東益康中藥器械有限公司；CV-600恒溫水浴鍋(上海福馬實驗設備有限公司)；BD-126W冰箱(青島海爾電器集團)；PHS-3E型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；JD500-2型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀FT-IR-4100(佳司科上海貿易有限公司)；FW-5A布魯克紅外用壓片機(天津博天勝達科技發展有限公司)； HF-2B紅外壓片模具(天津拓普儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)；Tescan-vega3掃描電子顯微鏡(德國Bruker公司)；IB-3離子鍍膜儀(日本Eiko公司)；三重四級桿串聯質譜儀1290 Infinity II UHPLC/6460 QqQ MS(美國Agilent科技公司)；AA-6300C石墨爐原子吸收分光光度計(日本島津公司)；DSC250差示掃描量熱儀(美國TA儀器公司); TG209F3熱重分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司)；D8 Advance X-射線衍射儀(德國Bruker公司)。

1.2 實驗過程

1.2.1 L-天冬氨酸螯合鈣的制備[10]根據實驗室前期優化的條件，取清洗干凈的烘干牡蠣殼→用榔頭敲成碎塊狀→將牡蠣殼碎塊放入高速萬能粉碎機中，調至一檔粉碎→粉碎后的殼粉過300～200目篩→將L-天冬氨酸和過篩牡蠣殼粉按摩爾比2∶1配料→加5倍氨基酸和殼粉總質量的蒸餾水→加熱至50 ℃→調節pH至5.0→恒溫磁力攪拌90 min→趁熱過濾→減壓濃縮至粘稠狀→乙醇沉淀→離心收集沉淀→冷凍干燥得到L-天冬氨酸螯合鈣。

1.2.2 L-天冬氨酸螯合鈣的定性檢驗[11]取1～3 g樣品，加入50 mL無水乙醇，攪拌靜置一段時間后過濾，向濾液中加入二硫腙試劑。若溶液變紅，說明樣品中可能存在游離金屬離子，繼續用乙醇洗滌，直至二硫腙檢測不變色；之后再加入5滴茚三酮試劑，電爐加熱沸騰2～3 min。若溶液不變色，說明樣品中無游離氨基酸；若溶液變為藍紫色，需用無水乙醇繼續分離純化，直至完全去除；之后加入過量硫化鈉，靜置一段時間。若有大量白色沉淀產生，說明硫離子置換出螯合物中的鈣離子，過濾去掉沉淀，收集濾液；向濾液中加入5滴茚三酮試劑，電爐加熱沸騰2～3 min。若溶液變為藍紫色，證明硫離子置換出螯合物里的鈣后，螯合態的氨基酸變為游離氨基酸。

1.2.4 L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜分析 取適量的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣于瑪瑙研缽，在紅外烤燈下分別與少量干燥的光譜純KBr充分研磨，使其粒度在2.5 μm以下，將混合粉末裝入壓片模具，于紅外用壓片機上抽氣加壓，壓力為900 kg/cm2，維持1.5 min，卸掉壓力得到透明的KBr薄片，迅速放入樣品室，使用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1區間掃描，得到紅外光譜圖[5]。

1.2.5 L-天冬氨酸螯合鈣的一二級質譜分析 取少量經過純化的L-天冬氨酸螯合鈣樣品溶于超純水中，采用正離子模式進行一級質譜掃描，設置電壓175.0 V，掃描范圍m/z為100～1 000，水∶甲醇為7∶3 ，二級質譜碰撞誘導電離(CID)為碰撞能量值55%[13-14]。

1.2.6 L-天冬氨酸螯合鈣的XRD分析 采用X-射線衍射儀測定牡蠣殼粉、L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的結晶性能[15]。X-衍射條件為：Cu Kα輻射源管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度0.2°/s，步長0.02°，接受狹縫0.2 mm，用X射線在2θ=10°～80°范圍內測定樣品的X射線衍射強度。

1.2.8 L-天冬氨酸螯合鈣的TG分析 在氮氣氛圍中進行測定，溫度范圍為25～800 ℃，升溫速率10 ℃/min[17]。

1.2.9 L-天冬氨酸螯合鈣的穩定性分析[18-19]

1.2.9.1 L-天冬氨酸螯合鈣的熱穩定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，分別置于60、70、80、90和100 ℃水浴中加熱1 h，冷卻至室溫后用火焰原子吸收分光光度法測定游離鈣離子含量，每組樣品平行測定3次。螯合物的熱穩定性用鈣保留率表示，下同。

鈣保留率 =(處理后結合鈣量 / 初始總鈣量)×100%。

在具體工程數據管理中，數據管理指標可根據花溪區紅巖水庫往年記錄的基礎數據指標為核心，通過移民工程數據管理中的位置管理、數據拓撲關系管理建立對應指標數據。

1.2.9.2 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，然后用濃鹽酸和濃氫氧化鈉溶液迅速將溶液pH調至2.0～8.0，靜置2 h后，用火焰原子吸收分光光度法測定游離鈣離子含量，每組樣品平行測定3次。螯合物的酸堿穩定性用鈣保留率表示。

1.2.9.3 L-天冬氨酸螯合鈣的模擬胃腸消化穩定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，先經胃蛋白酶酶解1 h(pH=2.0, 37 ℃，加酶量為2 000 U/g)，再經胰蛋白酶酶解1 h(pH=8.0, 37 ℃，加酶量為2 000 U/g)，酶解后100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后用火焰原子吸收分光光度法測定游離鈣含量，每組樣品平行測定3次。螯合物的模擬消化穩定性用鈣保留率表示。

1.3 數據處理與分析

實驗結果采用SPSS進行顯著性分析，以P< 0.05表示差異顯著。利用Origin 2018軟件作圖。紅外光譜數據采用OMNIC處理和分析，XRD數據采用MDIJade6.0軟件進行處理和分析。所有處理均設置3次重復，以(平均值±標準差)表示。

2 結果與討論

2.1 L-天冬氨酸螯合鈣的定性檢驗

采用試驗中的檢測方法，未檢測到螯合物中游離的鈣離子和氨基酸。之后加入過量硫化鈉后有大量白色沉淀產生，表明樣品中有大量的鈣元素；再加入茚三酮，將其置于電爐上加熱一段時間后發現，溶液由黃綠色變為藍紫色，證明螯合鈣樣品中氨基酸的存在。這一結果與劉閃等[9]的研究結果一致。

2.2 L-天冬氨酸螯合鈣的表面結構分析

采用掃描電子顯微鏡對L-天冬氨酸螯合鈣進行表面結構表征，分別將樣品放大200和1 200倍，掃描結果見圖1。

從圖1(a)中可以看出，螯合物在放大200倍視野下，顆粒整體分布較為均勻，呈現團塊聚集狀，有細小顆粒附著其上。這種聚集狀可能是牡蠣殼中的鈣與L-天冬氨酸中的氨基氮原子和羧基氧原子相互作用，多個氨基酸之間通過鈣離子交聯相接，形成較大的顆粒，且顆粒間可能相互吸引從而形成聚集[20]。圖1(b)中顯示，螯合鈣的表面粗糙，而且有較多白色晶體吸附，這可能是一些鈣結晶。付文雯[21]觀察了牛骨膠原多肽螯合鈣的掃描電鏡圖片，也發現了表面“鑲嵌”的白色晶體，因而推測在L-天冬氨酸和殼粉中鈣的螯合反應過程中，還可能存在一定的吸附作用。

((a)螯合鈣, 放大200×; (b) 螯合鈣, 放大1 200×。(a)Chelated calcium, 200×; (b) Chelated calcium, 1200×.)

2.3 L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜分析

L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的傅里葉紅外光譜測定結果見圖2。對比L-天冬氨酸的紅外光譜圖，可以發現L-天冬氨酸與牡蠣殼粉經水浴螯合后，整體光譜波形出現了明顯的移動。在特征區，氨基的不對稱伸縮振動引起的3 031.07 cm-1處的寬吸收峰藍移至3 142.92 cm-1，說明L-天冬氨酸中的N-H鍵發生化學變化；同樣地，在指紋區，羰基的不對稱伸縮振動引起的吸收峰1 515.29 cm-1紅移至1 397.66 cm-1，這可能是由于L-天冬氨酸的氨基氮和羧基氧參與了配位反應，形成螯合物的結果[22]。另外，L-天冬氨酸在2 085.64 cm-1左右有一個吸收峰，但是螯合之后，在L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜圖中該峰消失了，這一結果與王青等[23]報道相符，也與日本特許公報中介紹的α-氨基酸在2 100 cm-1處有一特征峰, 絡合后該峰就消失的研究結果相一致[24], 進一步表明了螯合鈣的生成。而且，螯合鈣譜圖在1 603.52 cm-1處有一明顯的強吸收峰，說明L-天冬氨酸的氨基與殼粉中的鈣發生了較強的螯合作用，有力地證明了氨基酸螯合鈣的存在。這一結果與Nara等[25]的研究結果相似。

圖2 L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of L-Asp and L-Asp chelated calcium

2.4 L-天冬氨酸螯合鈣的一二級質譜分析

電噴霧質譜(ESI-MS)技術具有樣品用量少，檢測時間短，靈敏度和精確度高等優點，是目前研究金屬離子結合位點的有效手段之一[14]。圖3為以牡蠣殼為鈣源的L-天冬氨酸螯合鈣一級質譜圖，從圖3中可以得到m/z為100～1 000的離子分布情況。從圖3中可以看出，其他離子峰的響應信號都較弱，信號較強的母離子m/z為342.9，為單一化合物，這與王曉萍研究報道的小麥胚芽蛋白源鋅螯合肽的電噴霧質譜結果類似[26]。所合成的螯合鈣主要分子量可能為342.9，結合GB29226—2012可知，天門冬氨酸鈣的m/z理論值為304.2，樣品螯合鈣中最高響應峰為342.9，這可能是由于在正離子模式下，螯合鈣與系統中的K離子結合形成[M+K]+為343.2(342.9±0.5)的響應峰，且該峰響應值較高，表明所制備的L-天冬氨酸螯合鈣較純，符合GB29226—2012中天門冬氨酸鈣的結合方式，即兩個天冬氨酸與一個鈣配位。

以牡蠣殼為鈣源的L-天冬氨酸螯合鈣二級質譜如圖4所示，圖4是選擇圖3中m/z為342.9(誤差±0.5)的母離子進行歸一化能量19%的碎片結果。其中藍色標記處的342.8為碎片后所選母離子峰的低豐度質荷比，而圖4中m/z為276.4的子離子峰響應值最高，相比于母離子其相對分子量丟失了66.5，推測可能是螯合物結構中一些側鏈基團被破碎的結果。Zhao等[27]研究報道了純化肽(Phe-Asp)中的氨基和羧基可以與鈣螯合形成共用電子對的情況。

2.5 L-天冬氨酸螯合鈣的XRD分析

L-天冬氨酸、牡蠣殼粉和L-天冬氨酸螯合鈣的X-射線衍射譜圖如圖5所示。從譜圖中可以看出，L-天冬氨酸與牡蠣殼粉形成螯合鈣后，原料中主要吸收峰發生了顯著變化，晶面間距(d)和相對強度(I/I0)改變。螯合前，L-天冬氨酸的結晶度非常高，主強峰2θ=23.72°，I/I0=100%，晶面間距d=3.74，兩個次強峰2θ分別為11.80°和35.92°，I/I0分別是34.1%和25.9%，晶面間距d=7.49和5.86。牡蠣殼粉在2θ為29.58°和47.70°也顯示出其特有的方解石特征峰，I/I0分別為100%和22.2%。然而，在生成的螯合鈣中卻未發現特征衍射峰，只是在2θ=33.90°處有一個較寬的彌散區域，無結晶特性，即該螯合鈣為非晶態物質。何昇鴻等[28]研究發現殼寡糖與銅離子生成的銅螯合物也呈非晶態，其反應物譜圖中的強峰在螯合物中完全消失，表明了螯合物的形成。

2.6 L-天冬氨酸螯合鈣的DSC分析

通過比較螯合反應前后的DSC曲線圖，觀察熔融峰或其他熱轉變峰形、峰面積等的變化，可定性判斷有無化學反應或其他相互作用的發生[29-30]。圖6所示L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的DSC圖。從圖中可以看出，L-天冬氨酸和它的螯合鈣在27.5 ℃有一個強放熱峰。隨著溫度的升高，L-天冬氨酸在約31 ℃處出現拐點，吸熱速率趨向平緩，在圖中所示的溫度范圍內尚未達到其變性溫度，這與其熔點為230 ℃相符合。同樣地，其螯合鈣在31 ℃左右也出現拐點，吸熱速率減慢，但在約135 ℃時出現了一個寬的吸熱峰，這個溫度點可能即L-天冬氨酸螯合鈣的變性溫度。

圖4 L-天冬氨酸螯合鈣的二級質譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of L-Asp chelated calcium

圖5 L-天冬氨酸、牡蠣殼粉和L-天冬氨酸螯合鈣的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffractograms of L-Asp, oyster shell powder and L-Asp chelated calcium

2.7 L-天冬氨酸螯合鈣的TG分析

熱重分析是通過程序控制一定溫度條件，測量物質的質量隨溫度變化關系的技術，失重速率最大值與TG曲線的失重拐點相對應[31]。L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的熱重曲線如圖7所示。隨著溫度的不斷上升，L-天冬氨酸在溫度約260 ℃時出現拐點，質量開始迅速下降，L-天冬氨酸開始熔化，熱重百分比77.7%，當溫度達到390 ℃左右時，出現第二次峰形拐點，此時熱重百分比為49.8%，在約790 ℃時，其質量分數降至最低，趨于定值，失重78.1%，即灰分21.9%。

圖6 L-天冬氨酸及其螯合鈣的差示掃描量熱曲線Fig.6 Differential thermal curves of L-Asp and its chelated calcium

對于L-天冬氨酸螯合鈣來說，在溫度約135 ℃時開始出現質量損失，失重3.2%，這一結果與圖6中的螯合鈣在135 ℃附近開始變性的結果相對應。此外，與L-天冬氨酸的熱重曲線相一致的是，螯合鈣在260 ℃附近也有強烈的質量損失，樣品開始熔化，此時的熱重百分比84.2%，隨后在約412和770 ℃處有較快的分解現象。這與管海躍所報道的甘氨酸鋅螯合物在溫度約295 ℃時開始熔化，隨后發生分解相似[16]。但L-天冬氨酸螯合鈣在800 ℃左右尚未完全分解，其熱重百分比為37.1%，表明螯合后的熱穩定性得到了一定程度的提高。

圖7 L-天冬氨酸及其螯合鈣的熱重曲線Fig.7 TG curves of L-Asp and its chelated calcium

2.8 L-天冬氨酸螯合鈣的穩定性分析

2.8.1 L-天冬氨酸螯合鈣的熱穩定性分析 熱處理是一種常用于食品的加工方式，研究L-天冬氨酸螯合鈣在熱處理過程中的穩定性對其在食品工業中的應用具有重要意義。由圖8可知，隨著加熱溫度的提高，不同溫度下的鈣保留率變化不大，與對照組(Control check，CK)相比無顯著性差異(p>0.05)，這表明所制備的L-天冬氨酸螯合鈣具有良好的熱穩定性，持鈣能力不隨溫度的改變而發生顯著變化。

2.8.2 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩定性分析 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩定性見圖9。從圖中可以看出，隨著pH的增加，鈣保留率先增加后降低，在pH=6左右達到最大值，鈣保留率接近對照組，且與對照組無顯著性差異。之后鈣保留率顯著降低，在pH=10時出現了絮狀沉淀，可能是強堿性條件下氫氧根離子和鈣離子形成了氫氧化鈣沉淀，穩定系數大于螯合鈣。而在酸性較強條件下，氫離子的大量存在與鈣離子競爭性搶奪供電基團-NH2和-COOH，亦加速螯合鈣的解離，這與單因素優化實驗的結果相對應。而大多數食品的pH在5～8范圍內，且螯合鈣在該范圍內的鈣保留率均在90%以上，因此L-天冬氨酸螯合鈣可考慮作為鈣營養強化劑添加到大多數食品中。

圖8 溫度對L-天冬氨酸螯合鈣鈣保留率的影響Fig.8 The influence of temperature on L-Asp chelated calcium retention rate

(數據以均值±標準差表示，不同小寫字母表示差異有統計學意義(p < 0.05，單因素方差分析結合HSD進行事后檢驗)。Data were expressed as means ± standard deviations, with different lowercase letters marking significant differences (p < 0.05, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Turkey’s Honest Significant Difference (HSD) test).)

2.8.3 L-天冬氨酸螯合鈣的模擬胃腸消化穩定性分析 L-天冬氨酸螯合鈣受消化酶作用的影響見圖10。實驗結果表明，螯合鈣由胃蛋白酶模擬消化1 h后，鈣保留率顯著下降了近29%。之后，再經過胰蛋白酶處理1 h的鈣保留率恢復至87.6%，表明L-天冬氨酸螯合鈣具有一定的抗消化性。在模擬消化過程中，雖然鈣保留率有顯著下降，但是總體都高于70%，顯示其抗消化特性良好，且經過胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，仍保留了消化酶作用前的87.6%的持鈣能力。

(數據以均值±標準差表示，不同小寫字母表示差異有統計學意義(p < 0.05，單因素方差分析結合HSD進行事后檢驗)。Data were expressed as means ± standard deviations, with different lowercase letters marking significant differences (p < 0.05, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Turkey’s Honest Significant Difference (HSD) test).)

3 結語

本文通過掃描電鏡、紅外光譜和質譜等技術對L-天冬氨酸螯合鈣進行了結構表征，并研究了其物理化學特性。研究結果表明，螯合鈣的微觀形態整體呈團塊狀，結構較緊密。L-天冬氨酸中的氨基和羧基主要以配位結合形式參與了螯合反應。所制備的螯合鈣主要分子量響應峰值342.9，其結構符合GB29226—2012中天門冬氨酸鈣的結合方式。此外，理化特性研究表明，該螯合鈣為非晶態物質，具有良好的熱穩定性、酸堿穩定性，且在模擬胃腸消化過程后仍能保留87.6%的持鈣能力。

本文的研究結果完善了目前對牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣的結構及理化特性的研究，為牡蠣殼廢棄物的高值化利用及新型鈣營養強化劑L-天冬氨酸螯合鈣的生產、應用研究提供了理論依據，今后將進一步研究牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣對缺鈣大鼠骨密度和生物可利用性等方面的影響。