基于基因檢測診斷晚嬰型神經元蠟樣脂褐質沉積癥1例

陳星星，雷曉燕，孫永紅，胡筱霞，趙淑珍

(甘肅省人民醫院 兒科，甘肅 蘭州 730000)

神經元蠟樣脂褐質沉積癥(neuronal ceroid lipofuscinoses, NCLs)是一組遺傳異質性溶酶體貯積病，主要表現包括多種類型的癲癇發作、肌陣攣、智力運動發育落后或倒退以及視力損害[1]。主要病因為溶酶體蛋白酶的基因缺陷及結構蛋白的功能失調，導致神經細胞、皮膚上皮細胞、肌細胞和淋巴細胞內脂褐素沉積[1-2]。目前報道的發病率為(0.1～7.0)/10 萬，不同地區會有差異[3]，國內報道較少。NCLs最初根據發病年齡、臨床表現以及電鏡下沉積物特征在臨床上可分為嬰兒(Haltia-Santavuori)、晚期嬰兒(Jansky-Bielschowsky)、青少年(Batten，Spielmeyer-Vogt)和成人(Kufs)共4種亞型，而現今根據基因型，NCLs可分為CLN1～CLN14共14種亞型，其中CLN2和CLN3型較為常見[1-4]。

不同亞型的NCLs疾病根據發病年齡不同可有不同表現[1, 4-5]，其中CLN2為經典的晚期嬰兒型：2～4歲間發病，始發通常為癲癇發作和(或)共濟失調，隨后可出現獲得性里程碑式發育落后，難治性癲癇，共濟失調或進一步惡化，以及錐體征束表現。發作可表現為各種類型的肌陣攣發作、非典型失神發作、強直-陣攣發作。視覺障礙通常出現在4～6歲，并且進展迅速，最終視力喪失，大多數CLN2確診患者在臥床不起和失明后過早死亡，預期壽命從6歲到十幾歲。CLN2型疾病為常染色體隱性遺傳疾病，由TPP1基因突變所致，此基因編碼蛋白為三肽基肽酶，其可從蛋白質的N末端順序去除三肽[5]。該報道對一例結合臨床表型、全外顯子組測序技術(whole exome sequencing, WES)診斷的CLN2進行討論和研究，通過相關基因診斷技術和遺傳學分析對這類臨床表型隱匿，分型復雜的疾病進行再次認識。

1 資料與方法

1.1病歷摘要 患兒，男，4歲，主因“診斷癲癇20月，發現運動障礙伴語言發育倒退8個月”于2018-12-23入院。3歲1個月時出現間斷抽搐，4歲1個月開始出現運動、語言倒退、肢體抖動，5歲開始出現肢體抖動加重、視力下降、雙眼感光消失、失語、癱瘓在床。

1.2研究方法

1.2.1臨床診斷與家系分析 收集患者家族史、臨床表現、實驗室檢查等臨床資料。

1.2.2樣本采集與測序實驗 在患者及其父母知情同意的情況下，采取患者及其父母的外周血樣本，使用血液基因組提取試劑盒(UnigeneDx)進行DNA提取，并用Life Technologies 公司生產的Qubit測定DNA的濃度進行定量。參照KAPA HyperPlus(KAPA Biosystem, Roche)文庫準備試劑盒及SeqCapEZ捕獲試劑盒(NimbleGen, Roche)對基因組DNA進行片段化、末端修復、接頭連接及雜合捕獲，制備外顯子捕獲文庫。文庫采用HiSeq X Ten (Illumina)測序平臺進行雙端測序。該研究獲得甘肅省人民醫院倫理委員會的審查批準。

1.2.3數據分析及驗證 采用FASTQC(v0.11.5)對測序得到的原始數據進行質量評估，通過BWA軟件(v0.7.15)[6]工具將測序得到的.fastq文件比對到參考基因組上(基因組版本為hg19)，利用Samtools(v1.3.1)、Picard、GATK等工具對比對結果進行格式轉化、排序、去重、重排以及堿基質量矯正，利用Annovar工具對突變位點進行注釋[7-8]。最后根據美國醫學遺傳學和基因組學會(ACMG)分類指南并結合患者癲癇的臨床表型進行相關變異的篩選[9]。變異分析過程中參考公共人群頻率數據庫(ExAC、ESP、1000Genomes及gnomAD)與dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多種數據庫進行變異的致病性評估。根據分析所得的候選變異位點，在NCBI網站下載TPP1序列并設計聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)引物，對患者及其妹妹和父母的DNA 樣本進行PCR擴增后，通過Sanger測序進行序列的比對驗證。

1.2.4突變致病性預測與蛋白序列同源性比對 利用蛋白功能預測軟件(SIFT、Polyphen2及MutationTaster)對測序數據所得變異的致病性進行預測。通過Uniport及Ensembl數據庫查找并下載人及其他物種的TPP1蛋白序列，使用Jalview軟件進行蛋白同源序列比對[10]。

2 結 果

2.1臨床診斷與家系分析 患兒出生時視力正常，3歲1個月時出現間斷抽搐，曾就診于某三甲醫院，完善腦電圖、頭顱MRI等相關檢查后確診為癲癇，給予丙戊酸鈉口服治療，患兒抽搐有所好轉。于4歲1個月時家長發現患兒運動逐漸倒退，具體表現為不能獨自行走，走路不穩，正常行走不超過20 min，伴四肢不自主抖動，出現語言發育倒退，只能叫“媽媽”，且吐字不清，考慮運動障礙性腦病，且8個月來上述癥狀進行加重。入院體格檢查：意識清楚，精神尚可，呼吸平穩，面色尚可，無特殊面容，構音不清，言語笨拙，雙瞳孔等大、正圓，直徑約3 mm，對光反應靈敏，眼球運動充分，未見眼球震顫，頸軟無抵抗感，心肺腹查體未見陽性體征，四肢及關節無畸形，雙下肢肌力Ⅳ級，肌張力正常，走路不穩，伴軀干及四肢不自主抖動，雙下肢無水腫，神經系統查體雙巴氏征陰性；雙膝腱反射、跟腱反射、輪替試驗、指鼻試驗、跟膝脛等試驗不能配合檢查。輔助檢查：血常規、生化全套、血乳酸、血氨、同型半胱氨酸、銅藍蛋白、尿常規均正常。丙戊酸鈉血藥濃度在正常范圍。頸部血管超聲：雙側頸動脈、頸靜脈超聲未見明顯異常。動態視頻腦電圖示：異常幼兒腦電圖(背景活動偏慢，睡眠期雙側額、顳區為主多灶性棘波、棘慢波、尖波及慢波發放)。顱腦MRI示：雙側大、小腦半球腦萎縮改變，請結合臨床；右側上黏膜增厚(圖1)?；純河?歲11月時開始出現視力下降，視物不清，視野逐漸減小，至5歲時，雙眼感光完全消失，肢體不自主抖動加重，四肢無力，癱瘓在床，伴失語。該患者的發病年齡在4歲左右，視力進行性減退，臨床癥狀以癲癇，運動、語言倒退伴視力喪失為主。

圖1 雙側大、小腦半球腦萎縮改變

患者父母均未出現類似癥狀，家族中未出現類似病史。結合患者臨床表現、動態視頻腦電圖、頭顱MRI、基因檢測等相關檢查，診斷 JNCL，CLN2 型(晚嬰型)。

2.2全外顯子組測序與 Sanger 測序驗證 本次在受檢者TPP1 基因上檢出兩個突變位點：已報道的致病位點c.1424C>T(p.Ser475Leu)和 新發突變位點c.962A>G(p.His321Arg) ?；颊吒赣H樣本檢出 TPP1基因上c.1424C>T(p.Ser475Leu)(圖2)雜合變異；患者母親樣本檢出TPP1基因上c.962A>G(p.His321Arg)雜合變異(圖3)。一代測序證實，先證者的c.1424C>T 變異遺傳自父親，c.962A>G 變異遺傳自母親，這兩變異在染色體上為反式排列。TPP1基因突變會導致神經元蠟樣脂褐質沉積癥2型，遵循常染色體隱性遺傳。并對以上2個突變位點進行 Sanger 測序驗證，證明確實存在。

圖2 TPP1 c.1424 位點Sanger測序圖 TPP1基因c.1424C>T(p.Ser475Leu) 突變遺傳來自父親。 a.患者TPP1基因上檢測到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變；b.患者父親TPP1基因上檢測到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變; c.患者母親TPP1基因上未檢測到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變

圖3 TPP1 c. 962位點Sanger測序圖 TPP1基因c.962A>G(p.His321Arg) 突變遺傳來自母親。a患者 TPP1基因上檢測到 c.962A>G(p.His321Arg)突變；b患者父親TPP1基因上未檢測到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變；c患者母親TPP1基因上檢測到 c.962A>G(p.His321Arg) 突變

2.3突變致病性預測分析 突變位點1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)：①表示TPP1基因CDS區的第1424號核苷酸由C突變為T，導致編碼的第475號氨基酸由絲氨酸突變為亮氨酸；②此變異在普通人群中的最大攜帶頻率為0.039%，提示變異在普通人群中罕見(PM2);③ 此變異位于肽酶 S8/S53 功能結構域(PM1); ④ 此變異與已報道的另一致病變異 c.509-1G>C曾在CLN2患者中有檢出，兩者在染色體上為反式排列[11](PM3);⑤ 多個軟件(SIFT，MutationTaster，PolyPhen2)預測此變異有害(PP3)； ⑥此變異在 Clinvar 和 LOVD 數據庫中有多次提交記錄，其中至少有 2 例為疑似致病變異記錄； ⑦ 一代測序證實，先證者的父親也攜帶有此變異，先證者的母親和妹妹均未攜帶此變異，證實先證者的此變異遺傳自父親；⑧TPP1 基因編碼三肽基肽酶，其突變會導致CLN2，遵循常染色體隱性遺傳；⑨該例受檢者表型與 CLN2 疾病部分符合。根據ACMG指南(PM2+PM1+PM3+PP3)，暫將 c.1424C>T(p.Ser475Leu)變異判為疑似致病變異。

突變位點2 c.962A>G(p.His321Arg)：①此變異表示 TPP1 基因 CDS 區域的第 962 號核苷酸由 A 突變為 G，導致編碼的第 321 號氨基酸由組氨酸突變為精氨酸；②此變異在多個普通人群數據庫(1000g、ExAC 及 gnomAD)中未見報道，提示變異在普通人群數據庫中極為罕見(PM2)；③多個軟件(SIFT，MutationTaster，PolyPhen2)預測此變異有害(PP3)；④此變異位于肽酶 S8/S53 功能結構域(PM1)；⑤暫未發現此變異存在相關臨床或功能報道。一代測序結果顯示，先證者的母親攜帶有此變異，父親未攜帶，證實先證者的此變異遺傳自母親。此變異與本次檢出的另一疑似致病變異(c.1424C>T)在染色體上為反式排列，符合 CLN2 疾病的常染色體隱性遺傳模式。綜上，根據 ACMG 指南(PM2+PM1+PP3+PM3)，暫將 c.962A>G(p.His321Arg)變異歸為疑似致病變異。

2.4蛋白序列同源性比對 以上兩個突變位點，在人類和其他物種同源蛋白相同區域高度保守不易發生改變，TPP1表達蛋白第 475 位氨基酸基本為 Ser，第 321 位氨基酸基本為His(圖4)。

圖4 TPP1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)和TPP1 c.962A>G(p.His321 Arg) 蛋白序列同源性比對 a.TPP1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)蛋白同源性比對(紅色框標注的為變異位點，結果顯示此位點在多個物種中保守)；b.TPP1 c.962A>G(p.His321 Arg)蛋白同源性比對(紅色框標注的為變異位點，結果顯示此位點在多個物種中保守)

3 討 論

NCLs是一組遺傳異質性溶酶體貯積病，其臨床表現復雜，診斷主要通過臨床表現、病理、腦電圖、 影像學及分子生物學確診，由于診療水平有限，該病極易誤診。文中受檢者單憑基因檢測結果不能確診，但綜合臨床表現(與CLN2部分符合)、頭顱MRI結果、腦電圖資料及基因檢測結果最終診斷為CLN2?，F根據基因型可分為CLN1～CLN14共14種亞型，其中CLN2疾病為經典的晚期嬰兒型[1]。

CLN2遵循常染色體隱性遺傳，可由TPP1/CLN2突變導致其編碼的三肽基肽酶失活而引起CLN2的一系列臨床表現[5, 12]，該病尚無特效治療方法。國內報道的NCLs患者突變基因主要是 CLN1、CLN2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN7，臨床多表現為難治性癲癇、視力下降、智力下降、精神及運動功能障礙、性格行為改變、記憶力下降，且在中國人群NCLs病例報道中，嬰兒型(INCLs)13例(12.9%)，晚期嬰兒型(LINCLs)48 例(47.5%)，青少年型(Batten 型，JNCLs) 30例(29.7%)，成年型(ANCLs)10例(9.9%)；其中僅32例完善了基因檢測[13]。

由于大多數 CLN2 確診患者在臥床不起和(或)失明后過早死亡，然而，不可逆的神經退行性變通常發生在5歲確診之前[14]，最近批準的腦室內酶替代療法已被證明可以有效減緩CLN2疾病患者運動和語言功能的快速下降[15]，因此早期診斷對優化護理、改善患者生活質量就顯得更加重要。但是在我國，由于對該疾病認識低、臨床表現不明確以及診斷檢測的可及性有限，診斷延遲是常見的。但是在診斷方面，除了基因檢測，還有頭顱MRI、腦電圖均可提示CLN2疾病的診斷，例如，嚴重的小腦萎縮是MRI診斷時的主要表現[16]，腦電圖檢測到的光敏性也是CLN2疾病的早期標志[17]。

CLN2的主要病因為TPP1/CLN2基因突變引起溶酶體蛋白酶的基因缺陷及結構蛋白的功能失調，導致神經細胞、皮膚上皮細胞、肌細胞和淋巴細胞內脂褐素沉積[5]。目前已報道了的TPP1超過 100 種突變，包括錯義突變、無義突變、剪接變異、插入缺失等，突變分布整個編碼區[12]，但是目前TPP1在體內的底物尚不清楚，TPP1酶缺乏癥的分子、病理機制尚不清楚[18-20]。TPP1/CLN2基因位于11p15染色體上[21]，包含13個外顯子，長度為6.7 kb，編碼溶酶體外肽酶(TPP1)，酸化后以無活性的原酶形式被加工成一個46 000的蛋白質。成熟的酶從溶酶體降解的小多肽的氨基末端裂解三肽，并且具有弱的內肽酶活性[22]。

迄今為止，在389名TPP1缺乏癥患者中報告了131個TPP1基因變異，在CLN2疾病中，大多數患者(60%)有兩種常見的變異之一(c.509-1 G>C和C.622 C>T[p.(Arg208*)])，這兩個變異使密碼子過早終止，一直被報道有致病性[13]。如果患者有任何CLN2疾病的跡象，并且分子檢測發現TPP1中有任何致病或可能致病的變異，TPP1酶活性檢測可用于確診[5]。但是，在本例報道中由于實驗條件所限，尚未進行TPP1酶活性的檢測，這是本文的不足之處。

CLN2為常染色體隱性遺傳，即等位基因上有2個有害突變可能導致疾病的發生。 本文檢測到的TPP1: c.1424C>T(p.Ser475Leu)和c.962A>G(p.His321Arg) 在正常人群中發生概率極低。 TPP1 基因 CDS 區的第 1424 號核苷酸由 C 突變為 T，導致編碼的第 475 號氨基酸由絲氨酸突變為亮氨酸，此變異與已報道的另一致病變異 c.509-1G>C 曾在CLN2患者中有檢出，兩者在染色體上為反式排列[11]。此外，另一個突變位點c.962A>G(p.His321Arg)，提示TPP1 基因 CDS 區域的第 962 號核苷酸由 A 突變為 G，導致編碼的第 321 號氨基酸由組氨酸突變為精氨酸，此變異在多個普通人群數據庫(1000g、ExAC 及 gnomAD)中未見報道，提示變異在普通人群數據庫中極為罕見；此變異位于肽酶 S8/S53 功能結構域，表明該突變位點對TPP1蛋白的正常功能至關重要，目前暫未發現此變異存在相關臨床或功能報道。一代測序結果顯示，先證者的母親攜帶有此變異，父親未攜帶，證實先證者的此變異遺傳自母親。此變異與本次檢出的另一疑似致病變異(c.1424C>T)在染色體上為反式排列，符合 CLN2 疾病的常染色體隱性遺傳模式。以上兩個突變位點，在人類和其他物種同源蛋白相同區域高度保守不易發生改變，對行使蛋白質的正常功能具有重要意義。以上結果均支持 c.962A>G(p.His321Arg)可能為 CLN2 疾病新發現的致病突變。綜合以上遺傳學分析得出，TPP1 的復合雜合突變極有可能導致晚嬰型NCLs。

新生兒篩查是改善目前可治療疾病的早期診斷的最有效方法，有專家建議，用與串聯質譜檢測相兼容的酶底物測定TPP1活性，可支持未來大規模的NBS計劃[5, 23]。但是新生兒篩查CLN2項目的成功主要依賴于基因型-表型相關性的清晰性，因此，我們必須共同努力確定TPP1變異所導致的疾病可能性，以便通過人群篩選和診斷分子遺傳檢測來解釋檢測到的變異。隨著分子遺傳檢測作為小兒起病神經系統疾病的一線診斷檢測日益增多，全面的報告和數據共享至關重要。臨床上發現TPP1/CLN2突變攜帶者，下一代致病概率較高，建議進行早期遺傳咨詢及家系驗證。本研究可為該家系遺傳咨詢及再生育指導提供依據，新突變基因的發現也擴大了該基因的突變譜，為闡明 NCLs 遺傳機制提供線索和方向。