L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中4種有害醛類和熒光晚期糖基化終產物的影響

翁 婷 鄭 潔 黃才歡 歐仕益

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510000)

L-半胱氨酸鹽酸鹽是一種無色至白色結晶或結晶性粉末，有輕微特殊氣味和酸味。對亞硝酸鹽具有一定的清除能力[1]，具有抗氧化和防酶促褐變作用，能通過延緩龍眼氧化而保持果實品質[2]。L-半胱氨酸鹽酸鹽能夠減輕愈傷組織的褐變[3]，具有防止或推遲褐變的作用[4-5]。美拉德反應香精制備中，L-半胱氨酸鹽酸鹽能賦予肉香味并降低產品顏色[6]。

同時，L-半胱氨酸鹽酸鹽還是面粉改良劑[7]。餅干是常見的烘焙食品之一，其主要成分還原糖和蛋白質(氨基酸)在烘焙過程中發生美拉德反應賦予餅干獨特的色、香、味，但同時會伴隨一些有害物質的產生，如5-羥甲基糠醛、α-二羰基化合物和晚期糖基化終末產物(AGEs)[8-9]等。5-羥甲基糠醛對人體黏膜、橫紋肌和內臟具有刺激和損傷作用，具有基因毒性和遺傳毒性，且是衡量食品褐變的指標[10-13]。典型的α-二羰基化合物，如3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)是AGEs的主要前體物質[14]。α-二羰基化合物不僅存在于食品中，還在人體中產生，與一些慢性或者老年化疾病有關，如動脈粥樣硬化[15]、糖尿病[16]、阿爾茨海默癥[17]等疾病。還原性物質能夠有效抑制GO、MGO和AGEs的形成[18-19]。課題組[20]36-46[21]前期研究表明，半胱氨酸在生理條件下能與HMF、3-DG、GO、MGO形成加合物并降低細胞毒性。L-半胱氨酸鹽酸鹽應用在韌性餅干中用來改良其品質[22]，但是否能有效降低以上有害醛類和熒光AGEs還未見報道。

研究擬將不同劑量的L-半胱氨酸鹽酸鹽添加至面團中，研究其對餅干外觀和有害物質HMF、3-DG、GO、MGO、熒光AGEs含量的影響，以期為L-半胱氨酸鹽酸鹽在烘焙食品中的應用提供有益指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

低筋小麥粉：濰坊風箏面粉有限責任公司；

棕櫚油：廣州珠烽進出口貿易有限公司；

蔗糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、乙醇、鄰苯二胺：分析純，天津大茂有限公司；

5-羥甲基糠醛：純度98%，北京百靈威科技有限公司；

乙二醛、丙酮醛：質量分數40%水溶液，北京百靈威科技有限公司；

3-脫氧葡萄糖醛酮：加拿大TRC有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pH計：FE22型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

微型旋渦混合儀：XW-80A型，上海滬西分析儀器廠；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司；

色譜柱：ZORBAX SB-Aq型，4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫有限公司；

壓面機：WA-BYM-15SFT型，江蘇無錫市麥威電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 餅干的制備

(1) 配方：根據Zou等[23]的配方略有修改(見表1)。

(2) 制作步驟：先將氯化鈉、蔗糖、碳酸氫銨、碳酸氫鈉和半胱氨酸鹽酸鹽分別溶于水中，再加油混合均勻，然后加入小麥粉制備成面團。L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量分別為0.0，0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg，將面團用壓面機輥壓3次，制成厚度為3 mm的面皮，再用餅干模具制成長48 mm 和寬36 mm大小的餅干，置于預熱30 min后的烤箱中，在190 ℃下分別烘焙10 min和15 min后放置在干燥器中保存。

1.2.2 餅干pH與色度的測定 將1 g烘焙10 min的餅干磨碎，在15 mL水中超聲60 min，然后在室溫下靜置1 h，用pH計測其上清液的pH值，每處理重復3次。

表1 餅干配料

將焙烤10 min的餅干冷卻至室溫后，使用白度儀檢測餅干的L*(亮度)、a*(紅色/綠色)和b*(黃色/藍色)，每處理重復5次。

1.2.3 HMF的測定 將1 g烘焙15 min的餅干磨碎，在20 mL水中渦旋5 min充分混勻，10 000 r/min離心10 min，再加入10 mL水按重復提取一次，收集上清液用0.22 μm濾膜過濾。根據Huang等[24]的程序進行HPLC分析，分離操作在ZORBAX SB-Aq柱上進行，采用5%的甲醇溶液等度洗脫25 min。樣品進樣體積10 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃。HMF在284 nm 處檢測的標準曲線的回歸方程為Y=106 862X+1 767 141(R2=0.997，線性范圍10～600 μg/mL)。每處理重復3次。

1.2.4 GO、MGO、3-DG的檢測 采用衍生法(形成喹喔啉衍生物)、HPLC檢測。將1 g烘焙15 min的餅干磨碎，在20 mL水中渦旋5 min充分混勻，10 000 r/min離心10 min，再加入10 mL水重復提取一次。取1 mL上清液與100 μL 鄰苯二胺溶液(1.08 g OPD溶于10 mL甲醇中)渦旋1 min混合均勻，置于60 ℃ 的水浴鍋中避光衍生24 h，將衍生完的溶液通過0.22 μm 濾膜過濾，根據Ou等[25]的方法稍作修改進行HPLC分析，樣品分離在ZORBAX SB-Aq柱上進行，流動相A為0.1%乙酸—水，流動相B為甲醇，梯度洗脫，梯度程序設置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。進樣量50 μL，流速1 mL/min，柱溫40 ℃。在314 nm處對GO、MGO和3-DG進行定量檢測，分別繪制GO、MGO和3-DG的標準曲線進行定量，其中GO的濃度設置為0.01，0.10，0.20，0.30，0.40 μmol/mL，MGO濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/mL，3-DG濃度為10，20，40，60，80，100 μg/mL，得到GO、MGO和3-DG的標準曲線回歸方程如下：GO為Y=13 061 332X+47 122(R2=1.000，線性范圍0.01～0.40 μmol/mL)；MGO為Y=9 535 572X+22 714(R2=1.000，線性范圍0.1～1.0 μmol/mL)；3-DG為Y=96 487X-45 331(R2=0.998，線性范圍10～100 μg/mL)。每處理重復3次。

1.2.5 熒光AGEs的測定 將1 g烘焙10 min的餅干磨碎，在5 mL水中超聲20 min，10 000 r/min離心20 min，收集上清液。沉淀用2 mL水再提取兩次，合并上清液后用0.45 μm濾膜過濾，用水定容至10 mL。將上清液注入96孔黑色平板，每孔100 μL。參照Sadowska-Bartosz等[26]的方法，分別在325/440，330/415，365/480，325/434 nm(激發波長/發射波長)下檢測熒光AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸。每處理重復9次。

1.3 數據處理

每次處理重復3次以上，運用SPSS進行顯著性分析，使用單因素方差分析(ANOVA)中Duncan進行檢驗(P<0.05)，使用Excel進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干pH與色度的影響

由圖1可知，餅干的pH隨L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加呈下降趨勢，pH值從9.7下降至9.3，說明添加劑呈酸性能中和一部分面團中的堿。雖然餅干的pH值隨L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加有小幅降低，但數值依然在偏堿性范圍內。

褐變是餅干在烘焙時的主要變化之一，不僅影響產品外觀，還影響口感風味。研究[27]發現，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加會使酥性餅干品質變好。由圖2可知，餅干的L*值隨L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加而增加，而a*值和b*值隨添加量的增加而下降。說明L-半胱氨酸鹽酸鹽的增加使餅干紅度和黃度下降，白度增加，即餅干在烘焙時呈更亮的顏色。L-半胱氨酸能與褐變產生的醌類反應生成無色化合物[28]，所以添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可以在一定程度上改善餅干的色澤。

2.2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對HMF的影響

HMF是烘焙產品經熱加工產生的主要有害物質之一，常常用作焙烤食品的質量指標。模擬生理條件下，L-半胱氨酸可與HMF生成加合物從而消除HMF并降低HMF帶來的毒性[20]39-46。由圖3可知，L-半胱氨酸鹽酸鹽可降低餅干中HMF含量，當添加量達0.3 g/kg后，HMF顯著下降，降低幅度達84.7%(P<0.05)。繼續增加L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量，HMF降低緩慢，當添加量達1.5 g/kg后，HMF下降94.3%。在組成蛋白質的氨基酸中，L-半胱氨酸除了有氨基外還有一個巰基，更易與HMF發生Michael加成反應[29]。所以添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可顯著降低餅干中的HMF含量。

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對GO、MGO、3-DG的影響

二羰基化合物GO、MGO、3-DG等化學性質非?；顫?，可與蛋白質反應形成AGEs、丙烯酰胺、甲基咪唑等，危害人體健康，是熱加工食品中需要控制的有害物質[30]。

由表2可知，餅干中會產生較多的3-DG和MGO，而L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加可顯著減少餅干中3-DG、GO和MGO的含量，并存在劑量依賴關系。當L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3 g/kg時，GO和MGO含量顯著下降，分別減少了82.0%和72.1%(P<0.05)，3-DG含量下降了13.7%。添加量增加至1.5 g/kg時，GO和MGO含量分別下降了89.6%和85.0%，3-DG含量雖然只下降了69%，但總量下降了704.2 mg/kg，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽能有效清除餅干中GO、MGO和3-DG。

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

表2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中3-DG、GO、MGO的影響?

推測L-半胱氨酸鹽酸鹽降低二羰基化合物含量有兩種機制：① 美拉德反應初期，半胱氨酸與Amadori產物反應，阻止了Amadori產物的分子重排，抑制美拉德反應，從而減少了二羰基化合物的產生[31]；② GO、MGO和3-DG等二羰基化合物形成后，半胱氨酸可與其形成加合物，從而降低其含量[21]。

2.4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對熒光AGEs的影響

食品在高溫加工過程中，二羰基化合物會與蛋白質上的一些氨基酸殘基如賴氨酸、精氨酸反應形成AGEs，包括熒光和非熒光AGEs。熒光AGEs主要有乙二醛賴氨酸二聚體、丙酮醛賴氨酸二聚體、戊糖素、FFI、fluorolink、vesperlysineA-C等，非熒光AGEs主要有羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸等[32]。其中熒光AGEs常用于評價熱加工食品AGEs形成水平的指標[33-34]。食品中的蛋白質也會發生氧化，產生有害物質并降低蛋白質的營養價值。氧化過程中，蛋白質色氨酸和酪氨酸殘基被修飾產生熒光產物，主要有二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸，其可作為蛋白質氧化指標[26]。因此，采用熒光法研究L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中AGEs和蛋白質氧化的影響。

由圖4可知，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加，AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸的熒光值均顯著下降，且呈明顯的量效關系。當L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg時，熒光AGEs分別減少了8.9%，18.1%，25.5%，38.1%(P<0.05)。其作用機制可能是L-半胱氨酸鹽酸鹽抑制了AGEs的前體二羰基化合物的產生。L-半胱氨酸鹽酸鹽對蛋白質氧化的抑制作用強于對熒光AGEs的抑制作用，當添加量為1.5 g/kg時，二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸分別減少了53.0%，45.5%，51.4%(P<0.05)，接近甚至超過了半抑制率。其原因可能是L-半胱氨酸鹽酸鹽具有抗氧化活性，從而抑制了蛋白質中氨基酸的氧化。

3 結論

L-半胱氨酸鹽酸鹽在改善餅干外觀的同時，還顯著抑制餅干中活潑羰基化合物(HMF、3-DG、GO、MGO)和熒光AGEs形成，同時抑制蛋白質的氧化，且呈劑量效應，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽可應用于餅干制作中來控制其主要內源性化學污染物的產生。試驗也證實了活潑羰基化合物與L-半胱氨酸可形成加合物從而抑制AGEs的形成，且L-半胱氨酸鹽酸鹽對內源性污染物具有高效的清除能力[21]。后續可進一步探討L-半胱氨酸鹽酸鹽的作用機理以及其對焙烤食品風味形成的影響，為L-半胱氨酸鹽酸鹽在焙烤食品中的應用提供更多的科學依據。

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