響應面法優化雪膽多酚提取工藝

周子舜 段柯兆 全瑞蘭

摘要：以雪膽（Hemsleya chinensis）為試驗材料，采用Box-Behnken中心組合設計響應面優化的方法，優化雪膽多酚的提取工藝條件。以多酚提取率作指標，通過Design-Expert 8.0.6軟件，基于單因素試驗結果，建立雪膽多酚提取率與提取溫度、乙醇濃度、液料比、提取時間4因素3水平的數學模型。結果表明，雪膽多酚提取率模型擬合度較好，顯著性高，優化后的最佳提取工藝條件為提取時間59 min、乙醇濃度（V/V）50%、提取溫度74 ℃、液料比16∶1（mL/g），此條件下雪膽多酚提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g。

關鍵詞：雪膽（Hemsleya chinensis）;多酚;提取;響應面法

中圖分類號：R284 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0112-07

Abstract： Taking Hemsleya chinensis as the experimental material， the Box-Behnken central composite design and response surface methodology were used to optimize the extraction conditions of polyphenols from Hemsleya chinensis. The extraction rate of polyphenols was used as index. Based on the results single factor experiments， a mathematical model of 4 factors and 3 levels center combinations was established with the Design-Expert 8.0.6 software on the extraction temperature， ethanol concentration， liquid to material ratio， extraction time. The results showed that the fitting degree of polyphenol extraction rate model was good and significant. The best process parameters were extraction time 59 min， ethanol concentration （V/V） 50 %， extraction temperature 74 ℃， and liquid to material ratio 16∶1（mL/g）. Under these conditions， the extraction rate of polyphenols from H. chinensis was （1.479 6±0.004 1） mg/g.

Key words： Hemsleya chinensis; polyphenols; extraction; response surface methodology

雪膽（Hemsleya chinensis）是葫蘆科雪膽屬植物，是常見的中草藥，主要分布于云南省、四川省、貴州省等地[1，2]。雪膽的主要有效成分有雪膽甲素、雪膽乙素和齊墩果酸等，能清熱解毒和消炎殺菌，并用于治療上呼吸道感染、支氣管炎、細菌性痢疾、腸炎等疾病[3，4]。多酚類化合物是一類具有多個酚基團的次生代謝產物，廣泛分布于植物的皮、根、葉和果肉之中，具有清除自由基等生理功能，除了具有良好的抗氧化功能外，還具有降低血脂肪、增強人體免疫力、防止動脈硬化和血栓形成、促進腸胃消化等作用[5-8]，所以含有多酚的植物作為天然抗氧化劑，在生物醫藥領域受到廣泛的關注。

近年來，國內外學者對雪膽化學成分、藥理活性和作用機制等方面進行了大量研究，并取得較大進展[9，10]，但對雪膽多酚提取工藝的研究未見報道。為進一步研究雪膽并有效利用雪膽資源，本研究以雪膽為試驗材料優化多酚提取工藝，回流提取法是多酚的主要提取方法[11-17]，為有效且充分提取多酚，選用乙醇作為提取溶劑，采用回流提取法提取雪膽多酚，探討利用響應面優化雪膽多酚的提取工藝，為其開發利用提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料雪膽為葫蘆科雪膽屬雪膽，采自云南柯兆生物科技有限公司種植基地。經粉碎過100目篩，密封于干燥器中備用。

福林-酚試劑購自國藥化工集團有限公司，沒食子酸標準品購自上海源葉生物科技有限公司，無水碳酸鈉購自西隴化工有限公司，無水乙醇購自天津風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

722N可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;ISO9001電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;DRHH-1數顯恒溫水浴鍋，上海雙捷實驗設備有限公司;DC-600高速多功能粉碎機，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 雪膽多酚的提取 將雪膽塊莖放入粉碎機磨碎，過100目篩得到樣品置于干燥器備用。稱取4.00 g樣品進行回流提取，提取結束后趁熱過濾，待濾液冷卻至室溫后用提取溶劑定容至100 mL，得雪膽多酚提取液。

1.3.2 沒食子酸標準曲線的制作 根據Folin-Ciocalte法并稍作修改[18]。稱取0.01 g沒食子酸標品溶解于10 mL乙醇中并用去離子水定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。分別量取0、2、4、6、8、10 mL沒食子酸標準溶液于100 mL容量瓶中，再加入1 mL 福林-酚試劑，在室溫下反應5 min后加入2 mL 10%的碳酸鈉溶液，用去離子水定容，避光反應2 h，在765 nm處測定吸光度值，重復2次取平均值，以沒食子酸濃度和吸光度值分別為橫、縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。根據沒食子酸標準曲線計算雪膽提取液中多酚的含量和多酚濃度。

1.3.3 雪膽多酚提取率的計算 將沒食子酸標準溶液用10 mL雪膽多酚提取液替代，按“1.3.2”方法測定吸光度值，雪膽多酚提取液中多酚濃度由沒食子酸標準曲線的回歸方程計算得出，雪膽多酚提取率的計算公式如下：

[多酚提取率（mg/g）=C×Va×VbM×V] ? ? （1）

式中，C表示多酚濃度（mg/mL），Va表示容量瓶量程（mL），Vb表示提取液總體積（mL），M表示樣品質量（g），V表示取液量（mL）。

1.3.4 單因素試驗

1）提取時間。為探討提取時間對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，液料比10∶1（mL/g，下同），70 ℃恒溫水浴的提取條件下分別回流提取30、45、60、75、90 min。

2）提取溫度。為探討提取溫度對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，液料比10∶1，提取時間60 min，恒溫水浴溫度分別為50、60、70、80、90 ℃的提取條件下回流提取。

3）液料比。為探討液料比對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，提取時間60 min，70 ℃恒溫水浴，液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的提取條件下回流提取。

4）乙醇濃度。為探討乙醇濃度對雪膽多酚提取率的影響，設置提取時間60 min，液料比10∶1，乙醇濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%，70 ℃恒溫水浴條件下回流提取。

1.3.5 響應面試驗 基于單因素試驗結果，結合響應面Box-Behnken的設計方法，以多酚提取率作響應值，建立雪膽多酚提取率與提取溫度、液料比、提取時間、乙醇濃度之間的4因素3水平的數學模型（表1）。

1.4 數據處理

采用SPSS Statistics 20軟件進行LSD多重比較和方差分析（P<0.05），并用SigmaPlot 12.5和Design-Expert 8.0.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的建立

以沒食子酸濃度和吸光度值分別為橫、縱坐標繪制標準曲線，得到沒食子酸標準曲線的回歸方程為Y=69.086X+0.008 2，R2=0.999 6。由圖1可見，沒食子酸濃度在0～0.010 mg/mL與吸光度值線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對雪膽多酚提取率的影響 由圖2可知，當提取時間為60 min時，雪膽多酚提取率最高。當提取時間小于60 min時，過短的提取時間可能會使雪膽多酚提取不完全，但延長提取時間也可能會導致提取液中多酚被氧化，使雪膽多酚提取率降低，故將響應面試驗的提取時間設定為45～75 min。

2.2.2 提取溫度對雪膽多酚提取率的影響 由圖3可知，當提取溫度為80 ℃時，雪膽多酚提取率最高。當提取溫度小于80 ℃時，溫度的升高可能會加快溶劑對雪膽樣品的滲透速度，氫鍵更容易被破壞，因此雪膽多酚提取率呈上升趨勢。當溫度大于80 ℃時，高溫可能會引起樣品內多酚發生氧化或降解反應，使雪膽多酚提取率降低，故將響應面試驗提取溫度設定為60～80 ℃。

2.2.3 液料比對雪膽多酚提取率的影響 由圖4可知，當液料比小于15∶1時，雪膽多酚提取率隨著液料比的增加而增大，可能原因是當液料比增加后，樣品在溶液中的分散程度增大，增加了接觸面積從而提高提取率。當液料比為15∶1時，雪膽多酚提取率達到最大。當液料比達到15∶1后，溶劑趨于飽和，隨著液料比的增加雪膽多酚提取率反而減少，可能原因是當液料比過大時，可溶性蛋白、多糖和果膠等物質被提取出，多酚可能被這些物質吸附或與之反應，使多酚提取率減小，故將響應面試驗液料比設定為10∶1～20∶1。

2.2.4 乙醇濃度對雪膽多酚提取率的影響 由圖5可見，當乙醇濃度小于40%時，隨著乙醇濃度的增加，雪膽多酚提取率逐漸增大，可能原因是低體積分數乙醇無法有效斷裂多酚與其結合物之間的氫鍵，不利于多酚的提取。當乙醇濃度大于40%時，雪膽多酚提取率隨著乙醇濃度的增加反而減小。當乙醇濃度為40%時，雪膽多酚提取率達到最大，根據相似相溶原理，可能是由于雪膽多酚的極性與40%乙醇的極性相同，故將響應面試驗乙醇濃度設定為40%～80%。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 二次響應面回歸模型的建立 根據Design Expert 8.0.6統計軟件的分析，得到響應面的試驗設計，以雪膽多酚提取率作響應值，設計提取溫度、液料比、提取時間和乙醇濃度4因素3水平的數學模型，結果見表2。

2.3.2 回歸方程及方差分析 對響應面試驗結果使用Design Expert 8.0.6軟件進行分析可得表3，各因素與響應值的二次多項式方程為Y=14.25+0.30A+0.39B - 0.15C + 0.48D + 0.25AB - 0.047AC + 0.012AD-0.099BC- 0.17BD + 0.17CD - 0.47A2 - 0.75B2 - 0.92C2 -0.45D2。P水平是檢驗回歸系數的標準，當P<0.01 時，回歸方程極顯著;當P<0.05 時，回歸方程顯著;當P>0.05 時，回歸方程不顯著。

由表3可知，該模型的P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬誤差P值等于0.000 1，失擬誤差極顯著，表明模型與實際情況擬合較好，模型R2=0.957 4表明預測值和實測值之間存在高度相關性，并且能準確反映試驗因素對響應值的影響，所以可以使用此回歸方程并預測試驗結果?；貧w模型的顯著性檢驗表明，A、B、D對多酚提取率有極顯著影響（P<0.01），C、AB對多酚提取率有顯著影響（P<0.05），AC、AD、BC、BD、CD對多酚提取率影響不顯著，二次項影響均為極顯著（P<0.01）。提取因素對雪膽多酚提取率的影響大小為：乙醇濃度>液料比>提取溫度>提取時間。

2.3.3 兩因子間交互作用分析 由圖6可知4個因素中任意2個變量在其余變量取零水平時對雪膽多酚提取率的影響，各圖交互作用的趨勢都是先增后減，從各圖的變化幅度及等高線的疏密可以看出，圖a、b、c、e、f的交互作用不顯著。圖d響應面的坡度很陡，可以得出提取溫度和液料比的交互影響對多酚提取有顯著影響，從圖d可看出液料比軸的等高線變化稀疏，提取溫度軸的等高線變化密集，液料比變化曲面的變化幅度大于提取溫度，表明液料比變化對多酚提取率的影響大于提取溫度。

2.3.4 最佳工藝條件預測及驗證 通過Design-Expert 8.06軟件分析可得雪膽多酚的最佳提取工藝條件為提取溫度74.04 ℃、乙醇濃度49.6 %、液料比16.4∶1、提取時間59.06 min，此時能夠得到的多酚理論提取率為1.485 3 mg/g。為方便具體操作，將條件修改為提取溫度74℃、乙醇濃度50%、液料比16∶1、提取時間59 min，并測定3次雪膽多酚提取率，所得平均提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g，與雪膽多酚理論提取率1.485 3 mg/g相比誤差小，所建立的回歸模型可靠，最佳提取工藝可行。

3 小結

多酚提取方法主要包括微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法、酶解提取法和有機溶劑萃取法等。本研究以乙醇作為提取劑，采用回流提取工藝，以多酚提取率作指標，基于單因素（提取溫度、乙醇濃度、液料比和提取時間）試驗結果，采用4因素3水平的響應面設計優化雪膽多酚的最佳提取工藝，結果表明，雪膽多酚提取率模型擬合度很好，雪膽多酚的最佳提取工藝條件為提取溫度74 ℃、乙醇濃度50%、液料比16∶1、提取時間59 min，此條件下雪膽多酚提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g，與雪膽多酚理論提取率1.485 3 mg/g相比誤差小，驗證該模型是有效的。提取因素對雪膽多酚提取率的影響大小為：乙醇濃度>液料比>提取溫度>提取時間。

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