不同基因型人乳頭瘤病毒感染所致尖銳濕疣皮損中p16、Akt 的表達及意義

黃尾全 王丹麗 蔣元德

( 廣東省東莞市厚街醫院 廣東 東莞 523945)

尖銳濕疣是由HPV 引起一種皮膚科常見性病，目前治療方法有藥物、激光、電灼、光動力療法等，但容易復發，給病人造成較大的困擾，本研究探討尖銳濕疣的復發與皮損部位p16,Akt的表達差異是否有關聯，以及HPV 各亞型p16,Akt 的表達是否存在差異。

1.病例收集

病例入選標準：選取2017 年9 月—2019 年12 月80 名符合中國疾病預防控制中心制訂的尖銳濕疣的診斷標準的患者，年齡18 ～52 歲，男女性別比例相同，初次發病首次就診病例。近1 月內未接受系統治療，2 周內未接受局部治療者。為排除其他疾病的影響，月經期、孕婦、哺乳期女性不做為觀察對象，有生殖器部位細菌、滴蟲、真菌、感染或合并其他疾病、有全身慢性消耗性疾病或者嚴重肝腎疾病患者不做為觀察對象。所有病例均簽署知情同意書。

2.方法

2.1 HPV 基因分型檢測

2.1.1 檢測儀器及試劑 香港凱普公司的HPV 基因檢測試劑盒，美國ABI-700PCR 檢測儀。

2.1.2 HPV 分型原理及步驟 活檢取材采集CA 組織標本送本院檢驗科，由檢驗科嚴格按照試劑盒說明書進行操作，進行定量PCR 檢測分型，按HPV 分型結果分為低危型組、高危型組、高低?；旌闲徒M。

2.2 免疫組化測定組織中p16、Akt 表達

2.2.1 免疫組化 活檢取材采集CA 患者皮損標本，先用福爾馬林固定、石蠟包埋、連續切片，取健康成人包皮環切組織10 例做正常對照。切片常規脫蠟水化，3%過氧化氫甲醇溶液10min 阻斷內源性過氧化物酶，抗原修復液于微波爐中抗原修復 10min；非免疫動物血清37℃孵育10min；加入一抗4℃濕盒中過夜孵育，生物素標記的二抗37℃孵育30min，鏈霉素-過 氧化物酶（SP）復合物37℃孵育30min；DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。每次實驗陽性對照參考已知陽性片，陰性對照則采用PBS 替代第一抗體。

2.2.2 免疫組化結果判定 參照Krajewska 等的評分方法分別記錄標本中表皮基底細胞層和棘細胞層的評分，弱、中、強陽性表達強度按顏色顯示為黃色、棕黃色、棕褐色分別定義，并且計為1 ～3 分；然后按陽性細胞所占的百分比將＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞76%記為0 ～4 分；最后綜合兩部分得分。

2.3 治療方案

①物理方法：高頻電灼祛除疣體；②肌注γ 干擾素200 萬u，隔日一次，共10 次。

2.4 預后觀察

手術后3 個月內每2 周門診復查，3 個月后改為每月門診復查，隨訪6 個月，在患者復診期間如發現新發CA 病灶或者醋酸白試驗陽性均視為臨床復發。

2.5 統計學分析

采用SPSS19.0 軟件對實驗結果所得數據進行統計分析，計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

3.結果

3.1 p16、Akt 蛋白在各組中的表達，低危組Akt 表達陽性38 例，p16 陽性35 例，高危組Akt 表達陽性10 例，p16 陽性9 例，高低?；旌辖MAkt 表達陽性13 例, p16 陽性12 例，正常對照組Akt 表達陽性2 例，p16 陽性2 例；p16、Akt 表達陽性在各組之間差異具有統計學意義，P ＜0.01，均高于正常對照組，見表1。

表1 各組p16、Akt 蛋白陽性率比較[n（%）]

3.2 尖銳濕疣復發組Akt、p16 的評分均高于未復發組，兩組之間差異比較具有統計學意義，P ＜0.01，見表2。

表2 尖銳濕疣復發組與未復發組Akt、p16 的評分情況（±s）

例數Aktp16復發組311.95±0.422.11±0.38未復發組491.31±0.361.32±0.29 t-3.927.38 P-＜0.01＜0.01

4.討論

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的皮膚性病科常見性病，臨床表現主要為在生殖器及肛周附近的皮膚黏膜出現皮膚贅生物，患病率呈逐年上升的變化趨勢。有關研究統計有半數以上的患者在初次治療后可能會有尖銳濕疣的復發[1]。尖銳濕疣的具體復發原因目前并不明確，其可能與患者HPV潛伏感染、患者亞臨床感染、細胞過度增生和機體的免疫功能發生異常等因素相關[2]。

我們臨床上雖然治療CA 方法有很多種，包括手術、藥物、激光、冷凍、光動力療法等，但是尖銳濕疣的復發率還是較高，CA 復發的具體原因目前尚未完全闡釋清楚，CA 的易復發性可能與細胞過度增殖、HPV 感染型別、亞臨床感染和機體免疫狀態紊亂等相關聯。有文獻顯示，HPV 亞型混合感染的CA 患者復發率要高于單一亞型感染的CA 患者。并且發現高危型+低危型是主要引起復發的一種感染模式[3]。因此，HPV 亞型混合感染有可能是引起患者復發的重要原因之一[4]。探究其原因，我們認為，HPV 亞型混合感染可能更易造成機體局部免疫紊亂，從而干擾表皮細胞正常的生長周期，導致局部細胞凋亡不足。

p16 基因又叫MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，負調節細胞增殖及分裂，有人把它比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導致細胞增殖，導致腫瘤發生[5]。在宮頸癌研究中，p16 蛋白在宮頸癌中表達量明顯升高，考慮p16 的高表達與HPV感染有關。在正常細胞周期調控過程中，p16 通過視網膜細胞瘤蛋白（Rb 蛋白）發揮作用[6]。而在HPV 感染時，HPV 病毒基因E7 與PRb 結合，導致p16 蛋白反饋性增高，但此時p16 的生理功能卻喪失[7]。本研究發現p16 在高危型患者陽性率為75.0%，高低?；旌闲蜑?0.5%，低危型為78.6%，正常對照組為20%，各組之間比較差異具有統計學意義，復發組評分2.11±0.38，未復發組評分1.32±0.29，兩組比較差異具有統計學意義，本研究發現尖銳濕疣的復發可能與p16 蛋白反饋性增高，失去了正常的抑制細胞生長周期的功能。

Demeter、馮進云等[8,9]研究顯示CA 皮損的表皮細胞發生比較明顯的細胞增殖，除基底細胞層外，發現棘層甚至顆粒層細胞均有增殖活性，而表皮細胞凋亡卻沒有相應的增加。從而容易導致皮損的復發。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為蛋白激酶B（protein kinase，PKB）?；罨腁kt 可以產生抑制細胞凋亡的作用，從而促進細胞周期運行[10,11]。本研究發現Akt 高危型患者陽性率為83.3%，高低?；旌闲蜑?6.4%，低危型為74.5，正常對照組為20%，各組之間比較差異具有統計學意義，說明HPV 感染Akt 表達高于正常人，而Akt 的過表達可能可以抑制細胞凋亡的發生，而且高危型和高低?；旌闲途哂诘臀Ｐ?，說明這兩組患者可能更易復發，在臨床治療中應更加重視此類患者的治療，并且我們發現，在復發的尖銳濕疣患者中Akt 評分1.95±0.42，高于未復發組評分1.31±0.36，差異具有統計學意義，進一步證明了Akt可能參與了CA的臨床復發，我們推測HPV 可能通過抑制細胞凋亡，使細胞永生化，從而逃避宿主的清除，從而引起尖銳濕疣的復發。

總之，本項目研究各發現尖銳濕疣復發患者的Akt、p16的表達水平高于未復發者，說明尖銳濕疣的復發可能與皮損中Akt、p16 蛋白的過表達存在關聯，為臨床上尖銳濕疣起病原因、疾病轉歸、疾病的防御及治療提供更扎實的理論基礎。