玉米秸稈低溫降解復合菌系降解能力及微生物組成研究*

青格爾, 于曉芳**, 高聚林**, 王志剛, 胡萬吉, 鬧干朝魯, 王 振, 胡樹平, 孫繼穎, 屈佳偉

玉米秸稈低溫降解復合菌系降解能力及微生物組成研究*

青格爾1,2, 于曉芳1,2**, 高聚林1,2**, 王志剛1,2, 胡萬吉1, 鬧干朝魯2,3, 王 振2,3, 胡樹平2,4, 孫繼穎1,2, 屈佳偉1,2

(1. 內蒙古農業大學農學院 呼和浩特 010019; 2. 內蒙古自治區作物栽培與遺傳改良重點實驗室 呼和浩特 010019; 3. 內蒙古農業大學園藝與植保學院 呼和浩特 010019; 4. 內蒙古農業大學職業技術學院 包頭 014100)

根據還田秸稈配施尿素的生產實際, 對玉米秸稈低溫高效降解復合菌系GF-20進行氮源培養基馴化, 探明其菌種組成和功能多樣性及其與菌源菌種結構差異, 完善復合菌系篩選方法, 促進其開發利用。本文以低溫高效降解復合菌系GF-20為研究對象, 在硫酸銨和尿素不同配比下連續繼代培養10代, 獲得不同氮源菌系(硫酸銨處理N1, 硫酸銨和尿素混合處理N2-N5, 尿素處理N6), 測定其玉米秸稈降解率, 評價復合菌系秸稈降解效率; 采用MiSeq高通量測序對菌源土壤樣品及不同氮源下繼代培養的復合菌系菌種組成和功能多樣性進行研究。結果顯示N2處理玉米秸稈降解率顯著高于其他處理; 菌源土壤的Alpha多樣性指數顯著高于繼代培養后的復合菌系, 不同處理間N2處理顯著高于其他氮處理; 菌源和復合菌間以及不同氮處理間菌種組成具有顯著差異, N2處理菌種組成多樣性較高, 菌群結構更加豐富、均勻, 且碳水化合物的代謝通路豐度較高。菌源經限制性繼代篩選后得到了參與玉米秸稈降解過程的功能菌, 能有效提高秸稈降解率, 其在硫酸銨和尿素氮源為0.16%+0.04%的條件下, 菌系的秸稈降解效率較高, 這為復合菌的生產實際開發利用提供了理論依據。

菌源; 復合菌系; 氮源; 高通量測序; 菌種組成多樣性; 玉米秸稈降解

秸稈還田是提高秸稈資源綜合利用率、平衡農田生態系統和實現農業可持續發展的有效措施[1]。由于玉米()秸稈木質纖維素的結晶區域組成, 使得還田玉米秸稈難以降解[2]; 而北方高寒地區秋冬季低溫、干燥等氣候因素進一步限制了還田玉米秸稈的有效腐解。因此, 在低溫條件下施加外源菌劑加速分解木質纖維素對玉米秸稈資源的開發利用具有重要意義。根據秸稈酶解過程以及微生物間的協同關系, 直接從自然環境中篩選或組配秸稈高效降解復合菌群, 用以提高還田秸稈的降解效率是目前秸稈高效降解的有效途徑之一[3-4]。其中, 菌源的選擇、復合菌群的篩選馴化方法對于獲得秸稈高效降解微生物成敗至關重要。前人研究表明, 根據應用目的從相似的生態環境中可篩選到更高效適宜的菌種[5]。Li等[6]和Feng等[7]以高溫期堆肥、腐爛作物秸稈和秸稈還田土壤為菌源, 篩選得到一系列中高溫復合菌系, 其秸稈降解率達30%~50%, 被應用于堆肥腐熟或南方高溫區秸稈還田。

本研究團隊為了獲得玉米秸稈低溫高效降解菌以用于北方低溫種植區玉米秸稈原位促腐還田, 從低溫(?7~8 ℃)生態環境中采集多年秸稈還田土壤作為玉米秸稈低溫高效降解復合菌系篩選的菌源材料,經長期的碳源限制性繼代培養與低溫馴化培養獲得一組微生物復合菌系GF-20[8], 其實驗室秸稈降解率達30%。但菌源材料與復合菌系GF-20間的菌種組成相關性及不同尿素含量處理對菌種組成的差異性尚不明確。這無疑關系到該菌系秸稈高效降解機理的揭示, 以及其能否被繼續開發、應用于生產實際。因此, 本研究以菌源樣品、篩選得到的復合菌系GF-20及其尿素氮源馴化后的系列菌系為材料, 通過對各復合菌系菌種多樣性、玉米秸稈分解能力和菌群結構特性等指標的測定及分析, 揭示復合菌系GF-20與菌源材料間, 以及不同尿素氮源含量馴化得到的復合菌系間的菌種異同, 通過與COG(蛋白質直系同源簇)和KEGG(代謝通路)數據庫比對及菌株功能性分析從而確定復合菌系中的關鍵功能菌,以及菌系適宜的尿素氮源條件, 為該復合菌系的開發利用提供理論依據和技術支持, 也給其他高效降解菌系的篩選和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018—2019年在內蒙古農業大學玉米中心微生物實驗室(內蒙古包頭市土默特右旗溝門鎮)進行。

1.2 供試材料

菌源土壤(編號為Q, 為本文復合菌系GF-20的篩選菌源)取自內蒙古通遼市常年秸稈還田土壤(43.37°N、122.16°E, 海拔400 m, 年平均氣溫5.5 ℃)和吉林省長春市連續秸稈還田土壤(43.82°N、125.32°E, 海拔250 m, 年平均氣溫4.8 ℃)的混合樣品, 供試復合菌系為本實驗室篩選馴化的玉米秸稈降解復合菌系GF-20(編號為N1)[8]。玉米秸稈取自內蒙古農業大學蒙西綜合試驗站(內蒙古包頭市土默特右旗溝門鎮)試驗田收獲的玉米秸稈(C/N為48.98, 纖維素、半纖維素和木質素含量分別為51.24%、32.72%和9.15%, 全氮6.67 g·kg-1, 全磷2.78 g·kg-1, 全鉀11.48 g·kg-1), 洗凈烘干后剪成1~2 cm短節。濾紙選用Whatman No.Ⅰ濾紙, 裁成1 cm×10 cm大小。

1.3 培養條件

以基礎培養基[(NH4)2SO42.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、CaCO32.0 g、NaCl 0.2 g、蒸餾水1 L]為繼代培養基, 復合菌以5%~10%(/)的接種量接入裝有40 mL基礎培養基和1 g玉米秸稈碳源的100 mL三角瓶中, 置于10 ℃恒溫條件下靜置培養[9]。

1.4 試驗設計

基礎培養基中氮源設硫酸銨+尿素, 含量分別為0.16%+0.04%(N2)、0.12%+0.08%(N3)、0.08%+0.12%(N4)、0.04%+0.16%(N5)、0+0.2%(N6)。對復合菌系GF-20進行尿素馴化處理, 原始培養基為硫酸銨0.2%+尿素0 (N1), 在以上處理條件下連續繼代培養10代以上, 獲得不同菌系, 每處理均3次重復。

1.5 主要測定指標與方法

1)復合菌系玉米秸稈降解率的測定。將所得復合菌系以5%的接種量接入玉米秸稈培養基[9]中, 以不接菌的為對照(CK), 在10 ℃恒溫條件下培養15 d和30 d后, 采用失重法測定玉米秸稈降解率, 3次重復。秸稈降解率(%)=(0-1)/0×100%。0表示接種前培養基中的秸稈重(g),1表示培養結束烘干后降解剩余物重(g)。

2)MiSeq 16S rDNA擴增子測序。采用土壤基因組DNA提取試劑盒和細菌基因組DNA提取試劑盒(中國, 天根生化科技有限公司)提取菌源土壤和各復合菌系的基因組DNA, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。獲得的基因組DNA由北京奧維森基因科技有限公司(Allwegene Tech. Co. Ltd., Beijing)完成MiSeq高通量測序, 對獲得的數據通過序列拼接、過濾和去嵌合體得到優化序列, 進行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類及各分類水平注釋。

3)功能注釋?；跍y序得到的序列, 與COG(蛋白質直系同源簇)和KEGG(代謝通路)數據庫進行比對[10]。

4)數據統計分析。利用QIIME(v1.8.0)軟件以97%相似度水平將序列進行聚類物種分類的OTU, 獲得物種分類水平的比例信息及不同分類水平的群落結構; 通過Uclust(Version 1.8)、Usearch(Version 8.1.1861)等數據庫進行物種比對, 得到各水平的分類信息, 進行樣本組成及樣本間群落結構差異分析; 采用R(v3.4.4)軟件繪制各樣品在各分類水平的比較圖, 基于聚類結果, 進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 不同氮源下復合菌系玉米秸稈降解率

不同氮源條件下復合菌系GF-20的玉米秸稈降解率如圖1所示。不同氮源處理降解率均顯著高于CK; 不同處理隨著尿素比例的增加, 復合菌系GF-20玉米秸稈降解率呈先上升后下降趨勢。培養至15 d和30 d, 均以N2條件下復合菌系的玉米秸稈降解率最高, 分別為22.64%和37.58%, 較CK高15.85%和21.43%, 且顯著高于其他處理。

圖1 不同氮源處理復合菌系玉米秸稈降解率

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例為分別0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%、0+0.2%。CK為不加菌對照, 培養條件同N1。不同小寫字母表示不同處理間差異顯著。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively. CK is non-inoculated microbial consortium (control), and the culture conditions are the same as N1. Different lowercase letters mean significant differences among different treatments.

2.2 菌源樣品及不同氮源下復合菌系Alpha多樣性指數分析

所有樣品及處理覆蓋深度指數均在0.99以上, 說明本次測序結果基本能代表樣品的真實情況。菌源土壤平均OUT數為1 705, 顯著高于篩選獲得的復合菌系, 處理N1-N6平均OUT數為58; 由Shannon、PD whole tree、Observed species和Chao指數可知, 菌源土壤顯著高于處理N1-N6; 不同氮源培養基獲得的復合菌系表現為混合氮源處理(N2-N5)高于單一氮源處理(N1, N6), 且N2處理顯著高于其他處理, 其Shannon、PD whole tree、Observed species和Chao多樣性指數分別為4.36、6.14、59.93和62.45(圖2)。

圖2 菌源樣品及不同氮源處理復合菌系Alpha多樣性指數

Q為菌源土壤。N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例為分別0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%、0+0.2%。Q is original microbe source. The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively.

2.3 菌源樣品及不同氮源下復合菌系細菌群落結構分析

對所有樣品測序結果進行物種比對, 得到各水平的分類信息。門分類水平, 變形菌門(Proteobacteria)在所有樣本中豐富度最高(圖3a)。菌源樣品中變形菌門豐度為36.98%, 其他優勢門是放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi), 豐度分別為24.06%和10.64%; 復合菌系GF-20中變形菌門豐度為85.52%, 擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度為13.86%。綱分類水平, 在所有樣本中α變形菌(Alphaproteobacteria)β變形菌(Betaproteobacteria)和γ變形菌(Gammaproteobacteria)豐度較高。而黃桿菌綱(Flavobacteriia)在復合菌中豐富度較高, 在菌源中僅有0.32%(圖3b)。屬分類水平(圖4), 菌源主要由(5.00%)、(3.73%)、(3.13%)、節細菌屬(, 2.26%)、(2.24%)、壤霉菌屬(, 2.01%)組成, 復合菌系主要由纖維弧菌屬()固氮螺菌屬()黃桿菌屬()土地桿菌屬()假單孢菌屬()纖維菌屬()等組成, 且不同氮源處理豐度具有顯著差異。說明復合菌系及菌源樣品的菌群結構差異較大, 長期限制性繼代培養及低溫馴化培養顯著影響菌系菌種組成, 大量菌屬被淘汰。

不同氮源處理間, 在門分類水平, N1、N2和N6中擬桿菌門豐度較高, 為13.86%、37.01%和17.72%; 放線菌門在N2-N5中含量分別為1.18%、5.71%、6.29%和26.11%, 表現為隨著尿素含量的增加而增加。屬水平, N1-N6處理復合菌系的細菌菌群結構差異顯著(圖3c, 圖4), 復合菌系GF-20在N1條件下的優勢菌屬為纖維弧菌屬(74.54%), 其次為固氮螺菌屬(7.40%); N2的優勢菌屬為纖維弧菌屬(22.24%)、黃桿菌屬(9.35%)、土地桿菌屬(8.60%)和norank_c__(9.03%); N3主要由纖維弧菌屬(14.3%)、假單胞菌屬(55.72%)和纖維菌屬(5.48%)組成; N4主要由假單胞菌屬(56.82%)、纖維菌屬(5.80%)、德沃斯氏菌屬(, 5.44%)、芽殖桿菌屬(, 4.57%)和纖維弧菌屬(4.44%)組成; N5主要由纖維菌屬(25.98%)、(28.11%)、食酸菌屬(, 10.97%)和噬氫菌屬(, 6.36%)組成; N6的優勢菌屬為纖維弧菌屬(31.13%)、短波單胞菌屬(, 18.5%)、黃桿菌屬(12.8%)和無色桿菌屬(12.56%)等?？梢娔蛩睾繉秃暇礕F-20的細菌菌群結構影響較大, 培養基中加入尿素后使優勢菌種種類增加, 混合氮源效果尤其明顯。綜上所述可知, 菌源樣品和所篩選獲得的復合菌系, 以及不同氮源下的菌系間菌種組成差異顯著, 主要體現在放線菌門、擬桿菌門、變形菌門的纖維弧菌屬、假單胞菌屬、、黃桿菌屬、無色桿菌屬、纖維菌屬等參與秸稈降解微生物豐度的差異。

圖3 菌源樣品及不同氮源處理復合菌系門(a)和綱(b)水平群落結果及屬水平(c)Heatmap圖分析

將在所有樣本中豐度占比均小于0.02%的物種歸為Others。Q為菌源土壤。N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。Microbes with less than 0.02% abundance in all samples are classified as others. Q is original microbe source. The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5, and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16% and 0+0.2%, respectively.

2.4 不同氮源下復合菌系菌群群落結構Heatmap分析

根據所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息, 選取豐度top 20的屬, 繪制屬水平的Heatmap圖(圖3c)。在屬水平上, 不同氮處理復合菌系優勢菌屬不同, 混合氮源處理N2-N5的優勢屬數量多于單一氮源N1和N6處理, N1處理中的固氮螺菌屬等屬豐度在N6中顯著降低, 而豐度較低的如無色桿菌屬短波單胞菌屬噬氫菌屬根瘤菌屬()貪噬菌()等屬在混合氮源處理中成為優勢屬。

由圖3c和圖4可知, 復合菌系GF-20在N1條件下, 纖維弧菌屬的豐度為74.50%, 但在含有不同尿素比例氮源條件下繼代培養數量顯著變化, 尤其在混合氮源條件下隨著尿素含量的增加而逐漸減少至0.81%; 德沃斯氏菌屬在N1條件下豐度為0.99%, 但在N4處理中增加至5.61%; 黃桿菌屬、地桿菌屬、短波單胞菌屬、無色桿菌屬等在N1條件下豐度均很低, 但在含有尿素氮源的菌系中大量存在, 成為優勢菌屬。說明限制性繼代培養是有選擇性的進行篩選, 大量富集與秸稈纖維素降解相關的菌屬, 提高菌屬數量比, 從而促進秸稈的降解。纖維菌屬在N1條件下豐度僅僅為0.03%, 但在混合氮源處理下含量逐漸增加, 在N5處理下含量達27.31%; 假單胞菌屬在N1條件下含量為0.04%, 但在混合氮源N3和N4處理下數量劇增至57.68%和59.25%; 無色桿菌屬和鞘脂單胞菌屬()在N1處理中為0.08%和0.06%, 但隨著尿素含量的增加, 含量逐漸增加, N6處理增加至12.84%和3.59%;和在N1處理中含量為0.70%和0.14%, 在混合氮源N2處理中增加至3.91%和2.35%;在混合氮源處理N5中含量最高, 為29.75%;在N1處理中含量為1.68%, 在處理N2中增加至5.42%, 隨著尿素氮源的增加含量逐漸降低, 在N6處理中減少至0; 固氮螺菌屬和金黃桿菌屬()在N1處理中的豐度分別為7.2%、3.78%和2.86%, 但隨著尿素氮源的增加, 其含量逐漸減少, 尿素處理N6的含量減少至0。由此可知, 硫酸銨和尿素含量對復合菌系GF-20繁殖有明顯的影響, 由Alpha多樣性指數及菌群組成(圖2, 圖4)可知, N2處理中富集了更多的參與秸稈降解的微生物, 菌種組成多樣性較高, 菌群結構更加豐富。

圖4 菌源及不同氮源處理復合菌系細菌群落結構分布(屬水平)

Q為菌源土壤。N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%、0+0.2%。Q is original microbe source. The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, 0+0.2%, respectively.

2.5 不同氮源下復合菌系菌群結構PCoA分析及Rank Abundance分析

根據不同氮源處理菌種組成及進化關系進行PCoA分析, 結果表明樣品分布較為分散(圖5a), 說明不同氮源處理菌系間物種豐度及差異度均存在差異, 其中GF-20(N1)、N2及N6與N4和N5處理的距離較遠, 而N3、N4和N5的距離較近, 再次說明不同氮源處理, 顯著影響復合菌系菌種物種組成, 且相同氮源的組成菌群結構更加相似。Rank-Abundance說明物種豐富度和均勻度。由圖5b可知, N2處理水平方向曲線寬度最寬且平滑, 結合OTU指數分析發現, N2處理OUT數為60±0.88, 顯著高于其他處理, 較N1及N3-N6分別高13.12%、8.38%、5.84%、13.12%和47.15%(圖2), 說明N2處理物種組成更加豐富和均勻。

2.6 不同氮源下復合菌系菌群Venn圖分析

進一步在屬水平進行Venn圖分析, 統計樣本中所共有和獨有菌屬數目, 直觀體現各樣本的菌屬組成相似性及重疊情況。由圖6可知, 有32個屬為6個處理共有的, 被稱為核心微生物, 直接或間接參與玉米秸稈降解代謝, 主要由放線菌、α變形菌、變形菌、擬桿菌綱的纖維弧菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、纖維菌屬、德沃斯氏菌屬、無色桿菌屬等組成。

2.7 不同氮源下復合菌系功能多樣性預測分析

將不同氮源處理復合菌系測序獲得的序列與COG和KEGG數據庫進行系統功能預測分析。通過COG分析對潛在功能進行分類, 結果表明amino acid transport and metabolism (氨基酸運輸/代謝, E)、general function prediction only (一般功能預測, R)、signal transduction mechanisms (信號轉導機制, T)、function unknown (未知功能, S)的注釋豐度最多為主導功能(圖7)。將24個類別概括為4類: 信息存儲與處理(第1類)、細胞過程和信號傳導(第2類)、代謝(第3類)以及功能較差類別(第4類), 其中carbohydrate transport and metabolism(碳水化合物轉運和代謝)的相對豐度在N1和N2處理明顯高于其他處理, 說明其通過增加碳水化合物的運輸和代謝功能, 促進秸稈的降解。

圖5 不同氮源處理復合菌系屬水平PCoA (a)和RankAbundance (b)分析

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively.

圖6 不同氮源處理復合菌系屬水平菌種分布比較的Venn圖分析

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively.

通過KEGG數據庫比對(表1)發現, metabolism (代謝)功能注釋到的結果最多, 占全功能分類的60%以上, 不同處理間N2處理明顯高于其他處理。為進一步分析代謝途徑, 在KEGG第3分類水平進行分析, 選取豐度大于1.00%的路徑進行統計(圖8), 共獲得21條代謝路徑, ABC transporters(ABCT)和two-component system(TCSP)注釋最多,其中9條代謝途徑豐度呈N2大于其他處理, 其中包含fructose and mannose metabolism(果糖和甘露糖代謝)、starch and sucrose metabolism(淀粉和蔗糖代謝)和amino sugar and nucleotide sugar metabolism(氨基糖和核苷酸糖代謝)等相關碳水化合物的代謝路徑。再次說明復合菌系在氮源為硫酸銨和尿素含量為0.16+0.04% (N2)條件下, 增加碳水化合物代謝功能, 促進秸稈物質的降解。

圖7 不同氮源處理復合菌系COG功能注釋相對豐度

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively.

表1 不同氮源處理復合菌系KEGG注釋結果的第2類水平統計

續表1

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。RA%指相對豐度, log指注釋數量的log10。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, 0+0.2%, and respectively. RA% refers to relative abundance, and log refers to log10 of the number of annotations.

3 討論

本研究中菌源材料取自內蒙古通遼市常年秸稈還田和吉林長春市連續秸稈還田混合土壤樣品, 主要由放線菌(24.06%)、變形菌(36.98%)、酸桿菌(9.71%)、綠彎菌(10.64%)、擬桿菌(6.94%)、芽單胞菌(5.74%)等門組成, 富含降解纖維素、半纖維素、木質素的菌屬, 如鞘氨醇單胞菌屬(, 0.99%)、芽孢桿菌屬(, 0.22%)、梭菌屬(, 0.1%)、纖維弧菌屬(, 0.01%)、(0.02%)、纖維菌屬(, 0.07%)、(0.04%)、(0.14%)等, 從菌源樣品中經長期限制性繼代培養篩選出了玉米秸稈低溫高效降解菌系GF-20, 其在低溫10 ℃下的秸稈降解率達30%。復合菌系篩選馴化的最終目的是應用到秸稈還田土壤中, 通常以生態條件與目標菌系相近的常年秸稈還田土壤作為菌源篩選材料, 提高篩選效率及應用效果。

圖8 不同氮源處理復合菌系KEGG主要代謝途徑的相對豐度(>1.00%)

N1、N2、N3、N4、N5和N6的氮源為硫酸銨+尿素, 比例分別為0.2%+0、0.16%+0.04%、0.12%+0.08%、0.08%+0.12%、0.04%+0.16%和0+0.2%。The nitrogen resources of N1, N2, N3, N4, N5 and N6 are ammonium sulfate+urea with ratios of 0.2%+0, 0.16%+0.04%, 0.12%+0.08%, 0.08%+0.12%, 0.04%+0.16%, and 0+0.2%, respectively.

3.1 限制性繼代培養過程中保留菌屬分析

限制性繼代培養篩選過程中保留了在低溫條件下直接或間接參與木質纖維素降解代謝途徑的菌, 菌源樣品及復合菌系數量比高于0.1%的共有菌屬有9個(圖3, 圖4, 圖6), 其中纖維弧菌屬可分泌3~4種纖維素降解酶系, 具有木聚糖酶基因, 降解羧甲基纖維素、纖維素、半纖維素、幾丁質等, 如混合纖維弧菌(subsp.)、J3-8、等[11-12], 其中混合纖維弧菌屬于產纖維素酶類的兼性厭氧微生物, 分泌的纖維素酶屬于典型的低溫纖維素酶[13]; 土地桿菌屬和黃桿菌屬大多源自于土壤, 可利用秸稈降解中間代謝產物促進秸稈分解, 如sp.可分泌葡糖苷酶、糖苷水解酶, 可利用碳水化合物、醇類和糖苷類等[14-15],sp.sp.分泌過氧化氫酶、氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶等, 利用丙酸、乳酸等秸稈降解中間產物, 消除底物反饋抑制作用[16-17]; 復合菌系中還含有鞘氨醇單胞菌屬根瘤菌氫噬菌屬柄桿菌屬()等含量低但起到關鍵作用的菌, 其中鞘氨醇單胞菌屬和鞘脂菌屬()是降解多環芳烴(PAHs)的重要功能微生物, 如sp. GD542參與石油降解途徑[18],分泌過氧化氫酶和氧化酶, 代謝產生丙酸、琥珀酸、L-丙氨酰胺等有機酸類, 在秸稈分解初期調節培養體系pH值[19]; 氫噬菌屬通常分泌水解酶, 如為兼氧細菌, 分泌氧化酶[20]; La等[21]報道sp.等菌分泌氧化酶、過氧化氫酶, 促進秸稈物質的分解; 德沃斯氏菌屬的sp.等分泌過氧化氫酶, 利用木糖、戊醛糖、纖維素等[22-23]; 柄桿菌屬中的能降解水楊苷[24],分泌糖苷酶、均可在4 ℃低溫條件下生長, 分泌水解酶類,以纖維二糖、木糖為碳源產酸, 分泌葡萄糖苷酶[25]; 根瘤菌屬大多存在于根瘤菌中, 既可合成纖維素也降解木質素, 其中YS-1r具有木質素降解能力, 能夠降解各種木質素單體、二聚體以及柳枝草和紫花苜蓿的天然木質素, 并且分泌木質素過氧化物酶(LiP)[26-27]。由此可知, 復合菌系GF-20中保留了菌源土壤中的功能菌, 通過限制性培養使其大量擴繁, 大大提高豐度, 從而促進玉米秸稈的降解。

3.2 復合菌系菌種功能多樣性分析

復合菌系的限制性繼代篩選過程既是淘汰與秸稈降解無關或不適應培養基條件的菌屬過程, 也是富集木質纖維素降解菌的過程。復合菌系中保留的菌屬均直接或間接參與秸稈降解代謝過程, 或是分泌纖維素、半纖維素、木質素酶等直接降解木質纖維素, 如纖維弧菌屬德沃斯氏菌屬根瘤菌屬鞘氨醇桿菌屬寡養單胞菌()等; 或是分泌葡萄糖苷酶、水解酶、過氧化氫酶等消耗中間代謝產物纖維二糖、木糖、醛糖等, 促進秸稈的持續降解, 如氫噬菌屬土地桿菌屬黃桿菌屬、柄桿菌屬、、類芽孢桿菌屬()等; 有些菌產生氧化酶類, 調節發酵體系酸堿度維持中性水平, 協調降解秸稈, 如鞘氨醇桿菌屬黃桿菌屬等分泌氧化酶類, 利用乙酸、乳酸等中間產物, 調節發酵體系酸堿度維持中性水平, 協調降解秸稈; 有些菌可能與秸稈降解沒有直接關系, 是因為適應篩選培養基而得以保留。

通過COG和KEEG數據庫對復合菌系功能多樣性進行預測比對發現, ABCT和TSCP相對含量最多。就功能概況而言, ABCT可將氨基酸、脂質、脂糖、肽和無機離子(如金屬離子)轉運至細胞外部, 從細胞中攝取寡糖、多糖、單糖(例如纖維二糖、纖維糊精、葡萄糖、半乳糖和甘露糖); 而TCSP感知細胞外可溶性糖的存在, 并調節大多數糖苷水解酶(GH)和相關的ABCT, 調節糖類的轉運, 以促進復雜植物材料(例如半纖維素)的利用, 并將各種結構的產物(例如木糖)轉運到細胞中[28]。代謝功能注釋相對豐度大多表現為N2處理含有更多的碳水化合物代謝功能, 包括果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝以及氨基糖和核苷酸糖代謝等, 促進秸稈降解中間產物的代謝, 從而提高玉米秸稈木質纖維素的降解(圖1); 而部分代謝基因在N6處理中注釋豐度明顯高于其他處理, 說明在尿素氮源條件下, 復合菌系通過促進自身代謝, 從而適應培養環境(表1)。

3.3 復合菌系間差異菌屬分析

菌源土壤與其經過長時間限制性繼代培養篩選馴化獲得的復合菌系細菌群落結構具有顯著差異, 限制性繼代培養過程是微生物淘汰的過程, 具有隨機性。同樣, 將篩選獲得的復合菌系培養于不同條件下時, 細菌群落結構也有差異, 說明菌系內部關鍵菌株的數量比例隨著外界培養條件的變化而變化(圖5, 圖6)。根霉菌屬()在N2中含量較高,可直接利用纖維二糖、木聚糖等參與秸稈降解代謝途徑[29],而可利用纖維二糖、木糖等代謝中間產物[30]; 短波單胞菌屬和無色桿菌屬在N1和N2中豐度為0.05%、0.08%和0.59%、3.37%, 在N6中為18.90%和12.84%, 說明尿素為唯一氮源促進其生長,等均可分泌纖維素酶, 參與秸稈物質的降解, 短波單胞菌屬的sp.sp.等可分泌葡萄糖苷酶, 參與秸稈降解代謝[31],sp.sp.等可利用纖維二糖等代謝產物; 司美茹等[32]從被石油污染的土壤和焦化污泥中分離出無色桿菌屬的XL和SQ-1, 幾乎能徹底降解C12?C23和C27?C43的烷烴和多環芳香烴,能氧化木糖, 具有過氧化氫酶和氧化酶活性[32-33]; 纖維菌屬在混合氮源條件下豐度較高, 許多纖維菌屬的細菌應用于秸稈生物降解和生物修復領域, 其中分泌的纖維素酶活性高, 包括β-葡萄糖苷酶(GH1, GH3)、內切酶(GH6, GH9)、β-1,4-葡聚糖酶(GH48, GH5)和纖維二糖磷酸化酶(GH94)[33-34];在N2中的豐度顯著高于其他處理菌系,菌屬中的NS114T、Y620-1等具有纖維素降解能力[34-35]。

根瘤菌屬等6個豐度高于0.1%的屬在N1和N2中存在, 但N6中未檢測到, 可能是由于以上菌屬不能以尿素為唯一氮源, 在繼代過程中逐漸被淘汰或含量顯著降低; 短波單胞菌屬等8個屬在N1處理中含量很低, 但在N6中含量顯著增加, 說明尿素為唯一氮源促進以上菌種繁殖。另外,等9個屬在菌源土壤中未檢測到, 而在復合菌系中檢測出, 說明在繼代培養的條件下新增加了9個微生物屬, 可能來源于空氣, 隨繼代過程中被保留下, 或這9個微生物屬在繼代培養的條件下得到了大量繁殖, 數量增加, 在16S rDNA擴增測序中被檢測到。菌屬在N1中含量高于0.1%, 具有直接降解木質素的功能, 固氮螺菌屬豐度為7.40%,與固氮螺菌屬具有協同降解作用[36]; 寡養單胞菌()屬于纖溶微生物, 多報道于石油降解菌種, 具有降解烷烴類物質的作用[37];可分泌脲酶和糖苷酶, 常以尿素為氮源[38]; Lewin等[39]和Abt等[40]報道的纖維素降解復合菌系中有屬的; 在牛糞中富含降解纖維素和木質素的菌屬[41]; 類芽孢桿菌屬中的等篩選自土壤, 具有較高的纖維素酶活性, 可直接降解纖維素類物質[42];和在相關文獻中暫沒有報道具有秸稈或纖維素降解功能。

復合菌系通過調節微生物組成, 進一步調節其功能多樣性, 從而適應不同尿素含量培養條件, 進而促進秸稈的降解。不同氮源處理間, N2處理復合菌系Alpha多樣性指數顯著高于其他處理, 菌種組成多樣性較高,根瘤菌等參與秸稈降解途徑的菌屬含量增加, 促進其秸稈降解進程, 導致N2處理秸稈降解效率較高。

4 結論

菌源樣品及復合菌系間的Alpha多樣指數、OTU豐度和差異度、物種結構及含量均存在顯著差異, 不同氮源處理間, N2處理復合菌系的菌種組成多樣性較高, 菌群結構更加豐富、均勻。在限制性繼代培養過程中保留含量高于0.1%菌屬有纖維弧菌根瘤菌土地桿菌噬氫菌黃桿菌德沃斯氏菌柄桿菌鞘氨醇單胞菌等, 均可分泌水解酶和氧化酶, 直接或間接參與秸稈降解進程中; 在氮源硫酸銨和尿素含量0.16+0.04%(N2)配比條件下, 優勢菌種為纖維弧菌、黃桿菌、土地桿菌, N2處理較其他處理避免了單一氮源造成的局限性, 多樣性指數增加, 菌群組成結構優化, 碳水化合物代謝功能注釋相對豐度較高, 提高了秸稈降解效率, 為進一步開發秸稈還田促腐菌劑提供基礎。

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Straw degradation ability and composition of microbial consortium for corn straw decomposition at low temperature*

Qinggeer1,2, YU Xiaofang1,2**, GAO Julin1,2**, WANG Zhigang1,2, HU Wanji1, Naoganchaolu2,3, WANG Zhen2,3, HU Shuping2,4, SUN Jiying1,2, QU Jiawei1,2

(1. Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China; 2. Key Laboratory of Crop Cultivation and Genetic Improvement in Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010019, China; 3. Horticulture and Plant Protection College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China; 4. Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014100, China)

It is common practice to return field straw with urea to accelerate decomposition. To improve the microbial screening methodology and investigate the microbes responsible for decomposition of corn straw, nitrogen acclimatization of the microbial consortium GF-20 (GF-20) was performed. Compositional differences in the cultured microbial consortium and the microbe source were also evaluated. GF-20 was cultured until the 10thgeneration in variable nitrogen conditions [ammonium sulfate (N1), mixtures of ammonium sulfate and urea (N2-N5), and urea (N6)]. The corn straw decomposition ratio was determined to estimate the activity of the composite microbial system, and the composition diversity and function were analyzed by MiSeq high-throughput sequencing. The results showed that the N2 degradation rate was significantly higher than the other treatments. The bacterial source alpha diversity index (ADI) was significantly higher than the cultured microbial consortium, and the N2 ADI was significantly higher than the other nitrogen treatments. The bacterial composition also significantly differed between the source and consortium, as well as among the nitrogen treatments. The N2 treatment yielded the most diverse bacterial composition, with richer and more uniform flora structures and a higher carbohydrate metabolic pathway activity (which promotes corn straw degradation). Functional microbial strains involved in corn straw degradation were obtained after restrictive sub-generation of the microbial sources, which can accelerate corn straw degradation. The highest corn straw degradation efficiency of microbial consortium was observed with the 0.16% ammonium sulfate + 0.04% of urea nitrogen (N2) treatment. These findings provide a basis for developing microbial consortium used in commercial production decomposition.

Original microbe source; Microbial consortium; Nitrogen resources; High throughput sequencing; Composition diversity; Corn straw degradation

s: YU Xiaofang, E-mail: yuxiaofang75@163.com; GAO Julin, E-mail: nmgaojulin@163.com

S145.6

10.13930/j.cnki.cjea.200128

Feb. 26, 2020;

Jun. 21, 2020

青格爾,于曉芳, 高聚林, 王志剛, 胡萬吉, 鬧干朝魯, 王振, 胡樹平, 孫繼穎, 屈佳偉. 玉米秸稈低溫降解復合菌系降解能力及微生物組成研究[J]. 中國生態農業學報(中英文), 2020, 28(11): 1753-1765

Qinggeer, YU X F, GAO J L, WANG Z G, HU W J, Naoganchaolu, WANG Z, HU S P, SUN J Y, QU J W. Straw degradation ability and composition of microbial consortium for corn straw decomposition at low temperature[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2020, 28(11): 1753-1765

* 國家自然科學基金項目(31760353)、內蒙古自然基金項目(2020MS03086, 2018ZD02)、國家重點研發計劃項目(2017YFD0300804)、國家玉米產業技術體系項目(CARS-02-63)、農業部華北黃土高原地區作物栽培科學觀測實驗站(25204120)和內蒙古農業大學高層次人才引進科研啟動項目(NDYB2016-15)資助

于曉芳, 主要從事作物生理生態研究, E-mail: yuxiaofang75@163.com; 高聚林, 主要從事作物生理生態研究, E-mail: nmgaojulin@163.com

青格爾, 主要從事玉米生理生態研究。E-mail: qinggeer001@163.com

2020-02-26

2020-06-21

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31760353), the Inner Mongolia Natural Sciences Foundation (2020MS03086, 2018ZD02), the National Key Research and Development Project of China (2017YFD0300804), the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-02-63), the Crop Science Observation & Experiment Station in Loess Plateau of North China, Ministry of Agriculture, China (25204120) and the Advanced Talented Scholars of Inner Mongolia Agricultural University, China (NDYB2016-15).