嗜熱鏈球菌S10復合植物乳桿菌P-8發酵豆乳中揮發性風味物質的SPME-GC-MS分析

郭 帥 韓之皓 白 梅 孫天松 張和平 王記成

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業農村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018）

全球發酵產品市場中，發酵豆乳份額遠低于酸奶市場，豆腥味是制約其發展的主要原因[1-2]。發酵劑的改變可引起風味差異，對成品中風味物質數量與含量起關鍵作用。固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）技術具有靈敏度高，檢出限低，分析范圍廣，萃取條件溫和等特點，可直接與氣相色譜-質譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用。近年來，SPME 技術在食品風味分析，如釀造醋[3]、紅酒[4]、果蔬[5]等應用越來越廣。食品體系風味特征形成是揮發性物質相互影響共同作用的結果[6]。微量雜質存在也會導致整體風味改變，同一種物質的風味因濃度、結構不同而有所差異。本研究菌種嗜熱鏈球菌S10（Streptococcus thermophilus S10）是在乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫的406 株嗜熱鏈球菌中篩選得到的一株具有良好發酵大豆乳特性和弱化后酸能力較好的嗜熱鏈球菌[7]。植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8） 是本實驗室于2005年分離自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發酵酸牛乳樣品中的1 株具有優良益生特性的植物乳桿菌[8]。本試驗中采用SPME-GC-MS 技術和面積歸一法，結合主成分和聚類分析探究嗜熱鏈球菌S10 與植物乳桿菌P-8（S10+P-8）復合發酵豆乳樣品中揮發性風味物質以及引起豆腥味的關鍵物質含量變化，為發酵劑S10+P-8 商業化提供理論數據，為功能性發酵豆乳開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂大豆粉，蛋白質含量≥39%，黑龍江農墾龍王食品有限公司。

試驗用嗜熱鏈球菌S10 和植物乳桿菌P-8 直投式發酵劑由乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫提供；商業豆乳發酵劑1和商業豆乳發酵劑2（商業1，商業2）分別購自科漢森（中國）有限公司、丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5977B GC-MS 聯用儀、色譜柱為HP-5 毛細管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent 公司；手動固相微萃取進樣手柄、50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭，美國Supelco 公司。

1.3 試驗方法

將全脂豆粉（6.6%）與蔗糖（8%）混合后加入到60 ℃蒸餾水 （85.4%） 攪拌均勻，于65 ℃、30 MPa 條件下均質，95 ℃殺菌5 min，冷卻至（42 ±0.5）℃接種發酵劑[9]。樣品于42 ℃恒溫發酵至pH值低于4.50 后，轉至4 ℃過夜后熟結束。接種量依據商業發酵劑產品說明0.03 g‰添加，試驗組接種量比例按照S10∶P-8 為1 000∶1 添加，其中S10 添加量為2×106CFU/mL。

1.4 揮發性風味物質測定

GC 條件：HP-5 毛細管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 的速率上升至10 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率上升至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度為250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。MS 條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z 33～450；發射電流100 μA。萃取條件：萃取頭老化溫度250 ℃，老化時間15 min，平衡溫度50 ℃，平衡時間60 min；25 ℃解吸附3 min。

1.5 定性與定量分析

利用隨機攜帶Masshunter 工作站NIST 11 標準庫自動檢索各組分質譜數據，利用面積歸一化法計算各組分峰面積百分比（相對含量）。

1.6 數據處理

利用SPSS 21.0 軟件作為數據分析工具進行顯著性、主成分分析處理。作圖采用Origin lab 2017、SIMCA-P 14.1 和R 語言。

2 結果與分析

2.1 發酵豆乳樣品GC-MS 結果總體描述

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，對原豆乳及3 種發酵豆乳樣品發酵完成及后熟結束的揮發性風味物質進行富集，利用GC-MS 技術對發酵豆乳的風味物質進行檢測分析，經NIST 11標準庫檢索各組分揮發性成分，利用面積歸一化法計算各組分相對峰面積百分比，由表1可知，原豆乳共檢出32 種揮發性物質，與Zhang 等[10]研究結果相符。3 種發酵豆乳在發酵完成和后熟結束總計6 組樣品共檢出124 種揮發性風味物質，包括醛類、酮類、酸類、酯類、醇類、烷烴類和含氮化合物等。接種發酵劑不同，風味物質組成和含量也不同?？偡迕娣e代表樣品揮發性風味物質總量，除去萃取頭帶有少量硅氧烷類雜質峰，結合表1、圖1a總峰面積可知，經發酵后，3 種樣品風味物質總量相比原豆乳有顯著提高（P<0.05）；發酵完成與后熟結束相比有顯著變化（P<0.05），后熟結束含量更高；S10+P-8 組與對照組相比含量更高，具有顯著差異（P<0.05）。樣品中總揮發性物質數量如圖1b所示，3 種樣品發酵完成時風味物質數量分別是50 種、32 種和48 種，差異顯著（P<0.05）。后熟結束時風味物質數量分別是53 種、50 種和50種，無顯著差異。對照組發酵完成與后熟結束揮發性風味物質數量有顯著變化（P<0.05）。原豆乳和發酵豆乳樣品不同種類揮發性物質及相對百分含量如圖1c、圖1d所示，原豆乳與發酵豆乳樣品主要在酮類、酸類、醇類和烷烴化合物上存在顯著差異（P<0.05），S10+P-8 組與對照組無顯著差異；揮發性風味物質種類在醛類、酮類、醇類和烷烴類化合物有顯著差異（P<0.05）；與對照組相比，S10+P-8 組醛類化合物和醇類化合物含量少，差異顯著（P<0.05）；酮類化合物含量多，差異顯著（P<0.05）。

2.2 發酵豆乳樣品致豆腥味揮發性物質分析

表1 原豆乳及發酵豆乳樣品中揮發性風味物質SPME-GC-MS 分析結果Table 1 Major volatile compounds extracted from soybean milk and fermented soybean milk samples by SPME-GC-MS

（續表1）

（續表1）

（續表1）

發酵豆乳風味是多種揮發性微量風味物質共同作用而達到相對平衡狀態的復雜體系。豆乳中特有的豆腥風味是制約豆乳制品被消費者接受的主要問題，在西方國家更為明顯，研究者常用“豆腥味”、“生味”、“青草味”、“油脂氧化味”、“油漆味”和“金屬味”等術語描述豆腥味[11]。已有研究確定了影響豆乳及發酵豆乳風味的12 種最主要揮發性物質成分[10，12]，并認為這些物質能夠基本代表發酵豆乳整體風味。其中己醛、（E）-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、戊醇、乙酸、苯甲醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛這8 種化合物分別呈割青草的味道、生味、磨茹、酸味、苦杏仁味和辛辣味而不被人喜歡，因此定義為豆腥味物質；3-甲基正丁醛、（E）-2-辛烯醛、正壬醛和（E）-2-壬烯醛呈黑巧克力、青瓜、綠菜花和水果味，被人們喜歡，定義為非豆腥味物質。此外，有研究認為2-戊基呋喃呈豆腥味[13]，正壬醛含量較多時產生較濃油脂氧化味而引起不愉快味道[14]。乳酸菌發酵可有效降低或消除發酵豆乳豆腥味[9，15]，己醛是豆腥味揮發性物質的最主要成分[11]，1-辛烯-3-醇和（E）-2-己烯醛次之，1-己醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛等再次之。己醛含量降低程度可作為衡量發酵菌種對豆腥味降低效果的重要指標[10，12，16]。結合表1和圖2a可知，原豆乳及發酵豆乳樣品中上述揮發性物質除戊醇均有檢出，原豆乳己醛含量為33.27%，Achouri 等[17]研究了豆乳氣味的組成成分，結果發現豆乳中致豆腥味己醛有較高含量。樣品中呈豆腥味揮發性物質總含量如圖2a所示，經發酵后，3 種發酵豆乳樣品中致豆腥味揮發性物質總量均顯著降低（P＜0.05）；S10+P-8 組與對照組相比下降量更大，差異顯著 （P＜0.05），后熟結束時S10+P-8 組總量為24.33%，對照組分別是46.79%和44.59%。各致豆腥味揮發性物質含量變化如圖2b所示，樣品中主要衡量豆腥味濃淡的揮發性物質己醛含量均顯著降低（P＜0.05）；發酵完成與后熟結束相比，S10+P-8 組和商業2 組無顯著變化，商業1 組變化顯著（P＜0.05）；S10+P-8 組顯著低于對照組（P＜0.05），后熟結束己醛相對含量為5.62%，對照組分別是20.16%和15.44%；揮發性物質（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃含量明顯下降（P＜0.05），其余物質如1-己醇、苯甲醛含量增多，這與早期研究結果有差異，可能是發酵菌種或豆粉選擇導致[18-19]。結合上述結果可推測，部分豆腥味成分殘留可能是豆乳發酵體系中仍留存豆腥味的主要原因。此外，風味物質與大豆蛋白能發生疏水結合，其結合常數隨碳鏈數的增加而升高，可能是導致豆腥味在發酵過程中難以除去的原因[20]，如己醛等物質。在發酵豆乳中有時會產生具有淡淡“臭腳丫味”的風味物質，含量低于儀器檢測限，無法直接獲知其相關信息，結合已有文獻，此物質為異戊酸，是大豆發酵制品中常見的一種特征風味成分[21]。

圖1 原豆乳及發酵豆乳樣品揮發性風味物質總體分析Fig.1 Total analysis of volatile flavor substances in soybean milk and fermented soybean milk samples

圖2 原豆乳及發酵豆乳樣品中呈豆腥味揮發性物質總百分含量（a）和各物質所占百分含量（b）分析Fig.2 Total analysis Comparison of beany flavor of volatile flavor in soybean milk and fermented soybean milk

2.3 發酵豆乳樣品不同種類揮發性風味物質主成分分析

主成分分析是通過少數幾個主分量解釋多變量間的內部關系，使樣品中物質種類及含量有較客觀反映，發酵豆乳中揮發性風味物質的數據用主成分分析來處理是一種既可行的又科學的方法[22]。得分圖中樣品點越接近，其香氣組成及含量相似度越高。樣品點與不同種類風味物質在得分圖與載荷圖上越接近，說明有較高相關性。將原豆乳及發酵豆乳所含8 類揮發性風味物質進行主成分分析，主成分特征值及方差貢獻率如表2所示，經主成分分析發現，不同發酵豆乳樣品揮發性物質種類主要集中在前3 個主成分，累計方差貢獻率達到88.590%。由圖3a因子得分圖可知，在第1主成分上，7 種樣品從左至右共3 個集合出現較為明顯的區分，說明接種發酵劑不同對風味物質產生有較大影響，S10+P-8 組與對照組、原豆乳有較明顯區分和聚類趨勢，2 種對照組空間排布較接近，原豆乳與3 種發酵豆乳區分明顯。因此，可定性的認為試驗組與對照組、原豆乳的揮發性風味物質存在較大差異；第2 主成分無明顯規律。結合圖3a和圖3b可知，商業1 組和商業2 組發酵完成樣品與烷烴類化合物呈正相關；商業2 組后熟完成與醇類、脂類和酸類化合物呈正相關；商業1 組發酵完成、S10+P-8 組發酵完成和后熟結束與含氮和酮類化合物具有正相關；原豆乳與醛類和其它種類化合物具有正相關。

表2 原豆乳及發酵豆乳樣品與不同種類揮發性風味物質主成分特征值及方差貢獻率Table 2 Soybean milk and fermented soybean milk samples with different volatile flavors eigenvalues of principal components and their variance contributions

圖3 不同發酵豆乳樣品（a）和揮發性風味物質種類（b）主成分載荷圖Fig.3 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

2.4 發酵豆乳樣品主要揮發性物質主成分及聚類分析

在2.2 節中提到，發酵豆乳風味主要由幾種揮發性風味物質共同呈現，除前文提到的風味物質以外，雙乙酰、乙醛、乙酸、己酸及戊醇等物質也可對發酵豆乳風味進行修飾[23-24]。選樣品中檢測到含量較高的揮發性風味物質共22 種進行分析，其相對含量接近80%或更高，主成分特征值及方差貢獻率如表3所示，經主成分分析發現，主要揮發性物質主要集中在前4 個主成分，累計方差貢獻率達到94.468%。結合圖4a和圖3a可知，兩種主成分分析聚類相似，即選取主要揮發性物質進行統計分析可代表整體發酵豆乳風味。由圖4a和圖4b可知，S10+P-8 組發酵完成和后熟結束與乙醛、己酸、乙偶姻、雙乙酰、丙酮酸等物質呈正相關；兩種對照樣品與乙酸、苯甲醛、1-己醇、（Z）-2-庚烯醛等揮發性物質呈正相關；原豆乳樣品與1-辛烯-3-醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛、3-甲基正丁醛和己醛等呈正相關。結合表1和圖4b可知，S10+P-8組樣品風味與含有較多含量的乙偶姻、雙乙酰、乙酸、己酸和乙醛等揮發性物質有關。其中，雙乙酰、乙偶姻是發酵奶制品中重要的特征風味物質之一，可賦予發酵豆乳特有的呈“乳脂氣息”、“干酪香氣”和“豆香味”[23，25]；Blagden 等[19]發現乳酸菌發酵豆乳后可產生乳酸、檸檬酸和乙酸等有機酸，并將檸檬酸代謝過程中生成的α-乙酰乳酸轉變成具有發酵豆乳特征香氣的雙乙酰；乙酸、戊酸、己酸賦予發酵豆乳爽口酸味[26]；而乙醛與其它揮發性風味物質相互協同作用，可改善發酵豆乳風味[27]。3 種發酵豆乳后熟結束后，雙乙酰含量分別為8.77%、2.99%和1.06%，乙醛含量分別是2.89%、1.24%和1.50%。乙醛/雙乙酰的含量比例對發酵豆乳風味影響較大，當乙醛/雙乙酰比例在0.22～0.33 范圍內時，會呈現誘人的芳香味，否則會有酸腐味或其它令人不愉快的味道[27]。本研究檢出3種發酵豆乳乙醛與雙乙酰含量比例分別為0.30，0.41 和1.41，試驗組乙醛/雙乙酰比值對其持有豆香味和清香味有積極作用。雙乙酰和乙醛是發酵制品中特有的風味物質，它們對許多有害微生物有較強抑制作用，其含量差異可能與嗜熱鏈球菌菌株間差異性有關[28]。

表3 原豆乳及發酵豆乳樣品與主要揮發性風味物質主成分特征值及方差貢獻率Table 3 Soybean milk and fermented soybean milk samples with major flavor compounds eigenvalues of principal components and their variance contributions

圖4 不同發酵豆乳樣品（a）和主要揮發性風味物質（b）主成分載荷圖Fig.4 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

不同樣品主要揮發性風味物質聚類分析如圖5所示，S10+P-8 組發酵完成和后熟結束樣品，商業1 組后熟結束和后熟結束樣品，商業2 組后熟結束和后熟結束樣品揮發性風味物質種類和含量相似，分別聚為一枝，原豆乳與其它樣品差異顯著，這一結果與主成分分析結果相似。在所有樣品中，乙酰丙酮、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-己醇、雙乙酰、己醛、己酸和乙偶姻含量差異較大，己酸和乙偶姻含量差異最大；原豆乳中（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃、己醛和正壬醛含量遠高于發酵豆乳樣品，差異顯著（P＜0.05），這與施小迪[29]研究結果相符。由此可知，S10+P-8 組樣品具有更低含量致豆腥味揮發性風味物質，與對照組差異顯著（P＜0.05）。

圖5 原豆乳及發酵豆乳樣品聚類分析Fig.5 Soybean milk and fermented soybean milk samples cluster analysis

3 結論

本試驗應用SPME-GC-MS 技術，結合主成分分析和聚類分析研究S10+P-8 發酵豆乳中的揮發性風味物質。與兩種商業豆乳發酵劑相比，后熟結束時S10+P-8 發酵豆乳樣品的揮發性風味物質總峰面積更大，數量更多（52 種），致豆腥味揮發性物質相對總含量更低（24.33%），主要致豆腥味揮發性物質己醛含量為5.62%，呈豆香味和清香味揮發性物質，如乙偶姻、雙乙酰、乙酸、己酸和乙醛等含量較高，其中乙醛/乙偶姻的比例為0.30%，有誘人豆乳芳香味。S10+P-8 組與對照組、原豆乳在揮發性風味物質種類和主要揮發性物質上有明顯區分，各組分相對含量及致豆腥味風味物質含量均優于商業豆乳發酵劑1 和商業豆乳發酵劑2。本研究為S10+P-8 在商業化生產中提供了理論數據和參考依據。