烏魯木齊市寵物犬、貓糞源大腸桿菌耐藥性分析與ESBLs基因型檢測

佟盼盼 楊銀萍 謝金鑫 張萌萌 張 凌 唐雪林 張 毅 蘆 星 蘇戰強

(新疆農業大學 動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

我國寵物的擁有數量呈逐年增長趨勢，據《2019年中國寵物行業白皮書》(消費報告)數據顯示：預測到2024年，我國寵物犬、貓擁有數量達2.48億只，犬、貓儼然成為伴侶動物中的主流。研究表明犬、貓已成為致人類腸道和腸外感染的大腸桿菌的儲存庫[1]。由于寵物臨床的不規范用藥導致大腸桿菌的耐藥性日趨嚴重[2]，甚至出現了對β-內酰胺類抗生素耐藥的現象[2-3]。β-內酰胺類抗生素應用廣泛，屬于一線抗菌藥物，大腸桿菌對該類抗生素耐藥主要依賴于質粒介導的β-內酰胺酶，其中超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)受到廣泛關注[3-4]。

寵物攜帶耐藥大腸桿菌不但影響治療效果，且潛在從寵物傳播到人類的風險[2-3,5]。目前，國外已報道寵物可將耐藥大腸桿菌傳染給人類，嚴重威脅人類的健康[3,6]。近年來我國廣大科研工作者對細菌耐藥性及傳播機制做了大量的研究，主要集中在食源性大腸桿菌[7-8]，僅有幾個省份報道了寵物源大腸桿菌的耐藥情況[9-13]，其中很少有關新疆地區寵物源產ESBLs大腸桿菌的分子流行病學數據。因此，本研究旨在對烏魯木齊市犬、貓源大腸桿菌進行耐藥性分析，并對產ESBLs菌株進行β-內酰胺酶基因檢測，以期為指導寵物臨床合理用藥提供理論依據，同時為ESBLs在細菌中的流行病學和進化提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從2018年9月—2019年6月，從烏魯木齊市2家寵物醫院收集犬、貓肛拭子樣品，在采樣過程中接受體檢和接種疫苗的犬、貓記錄為健康寵物；出現體溫升高、食欲不振、精神萎靡，伴隨嘔吐、腹瀉等臨床癥狀的犬、貓記錄為患病寵物。共采集肛拭子樣品181份，包括犬源114份(健康犬33份，患病貓81份)，貓源67份(健康貓19份，患病貓48份)。

1.2 試劑及培養基

抗生素藥敏紙片氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環丙沙星、四環素、復方新諾明、氯霉素、多粘菌素和鏈霉素購自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液肉湯(BHI)、胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)、麥康凱瓊脂(MAC)、MH瓊脂(MHA)購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；科瑪嘉尿道定位顯色培養基購自上海欣中生物工程有限公司；質控菌株大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603由本實驗室保存。

1.3 大腸桿菌的分離鑒定

向裝有肛拭子樣品的采集管中加入2 mL 0.85%生理鹽水，室溫震蕩混勻10 min，靜置3 min，取10 μL混懸液加入BHI培養基中增菌，37 ℃，培養16 h。將增菌液劃線接種MAC平板，37 ℃，培養16 h，觀察菌落形態，每塊平板上挑取疑似大腸桿菌單菌落劃線接種科馬嘉尿道定位顯色培養基平板，37 ℃，培養16 h，取單菌落置于TSB中，37 ℃，培養16 h，利用大腸桿菌16S rDNA特異性引物(F:5’-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3’和R:5’-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3’，生工生物工程(上海)有限責任公司合成)進行PCR鑒定[14]，陽性菌置于20%甘油的生理鹽水中-80 ℃保存備用。

1.4 藥物敏感性檢測

采用K-B藥敏紙片法對寵物源大腸桿菌分離株進行藥物敏感性檢測。根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2016版執行標準，判定結果為耐藥(Resistance，R)、中介(Intermediate，I)或敏感(Susceptible，S)[15]。

1.5 ESBLs表型檢測

通過雙紙片協同試驗檢測產ESBLs菌株，同時使用頭孢他啶(30 μg)和頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)及頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)2對藥敏紙片，當頭孢他啶和頭孢噻肟中有任何一個，在加克拉維酸后，抑菌環直徑與不加克拉維酸的抑菌環相比，增大值≥5 mm時，判定為產ESBLs[15]。大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603為質控菌。

1.6 ESBLs耐藥基因檢測

采用煮沸裂解法提取分離株總DNA作為PCR模板，提取本實驗室保存的攜帶ESBLs耐藥基因的菌株總DNA作為PCR陽性對照。根據參考文獻[16-19]合成ESBLs耐藥基因，包括CTX-M(CTX-M-1G、CTX-M-2G和CTX-M-9G)、TEM和SHV，引物(表1)均由上海生工生物工程有限責任公司合成。PCR反應體系25 μL：Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min，根據不同擴增基因調整退火溫度。

表1 檢測耐藥基因的引物序列Table 1 Sequences of primers used to screen resistance gens

1.7 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0進行數據分析。單因素分析采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 寵物源大腸桿菌的分離鑒定結果

犬、貓肛拭子樣品增菌后劃線接種麥康凱平板，疑似大腸桿菌呈深桃紅色、圓形、扁平，邊緣光滑(圖1(a))，挑取單菌落在科馬嘉尿道定位顯色培養基上純化(圖1(b))，經大腸桿菌特異性PCR鑒定(圖2)，從181份犬、貓肛拭子中共獲得120株(66.3%)大腸桿菌，包括犬源71株，貓源49株。

圖1 寵物源大腸桿菌分離株菌落形態Fig.1 Colony morphology of E.coli isolates from pets

M, DNA標記DL 2 000; N, 陰性對照; 1,陽性對照E.coli 25 922; 2～4, 大腸桿菌分離株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, E.coli 25 922 as positive control; 2-4, E.coli isolates圖2 寵物源大腸桿菌分離株16S rDNA PCR擴增Fig.2 Amplification of 16S rDNA of E.coli isolates from pets by PCR

2.2 寵物源大腸桿菌的藥物敏感性

由表2可知，120株犬、貓源大腸桿菌對19種藥物均表現出了耐藥性，對四環素、氨芐西林、復方新諾明和哌拉西林的耐藥率在35.8%～60.8%；對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、環丙沙星和多粘菌素6種藥物的耐藥率在10.0%～29.2%；對亞胺培南、左氧氟沙星、阿米卡星、頭孢他啶、氨曲南、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林、頭孢吡肟和美羅培南的耐藥率在0.8%～10.0%；這些分離株對哌拉西林-他唑巴坦完全敏感。經雙紙片協同試驗后，35株(29.2%)大腸桿菌為產ESBLs菌株。這些大腸桿菌對鏈霉素、慶大霉素、環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率，患病犬高于健康犬，而患病貓低于健康貓，差異顯著(P<0.05)。與患病貓相比，健康貓源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率更高。

表2 寵物源大腸桿菌對抗菌藥物的敏感性Table 2 Antimicrobial sensitivity of E.coli strains isolated from pets

2.3 寵物源大腸桿菌多重耐藥性

20種抗生素包括四環素類、氨基糖苷類、磺胺類、β-內酰胺類、氯霉素類、喹諾酮類及多肽類共7類。多重耐藥的表型定義為同時對≥3類抗生素耐藥[20]。寵物源大腸桿菌多重耐藥表型的檢出率為48.3%(58/120)。如圖3所示，犬源和貓源分離株中均存在多重耐藥表型，且差異不顯著(P>0.05)，犬源分離株主要對3類抗生素產生耐藥(16.9%，12/71)，貓源分離株主要對4類抗生素產生耐藥(18.4%，9/49)；對6類抗生素耐藥菌株的分離率，患病犬顯著高于健康犬(P<0.05)，而健康貓顯著高于患病貓(P<0.05)。58株多重耐藥菌對3～14種抗生素耐藥，其中分離自患病寵物的2株大腸桿菌對14種抗生素耐藥，與健康寵物相比，患病寵物大腸桿菌的耐藥譜型更豐富。在健康和患病犬中均分離到對7類抗生素耐藥的菌株，而貓源分離株中不存在這樣的菌株。

0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R：0、1、2、3、4、5、6和7類結構不同抗菌藥物同時耐藥；*表示顯著差異，P<0.05。0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R refer the resistance of E.coli strain to 0,1,2,3,4,5,6, and 7 of different structure antibacterial drugs；*：Significant difference, P<0.05.圖3 大腸桿菌分離株多重耐藥菌株所占百分比Fig.3 Percentage of multidrug resistant strains of E.coli isolates

2.4 寵物源大腸桿菌ESBLs耐藥基因檢測

對35株產ESBLs分離株進行β-內酰胺酶基因CTX-M、TEM和SHV檢測，如圖4所示，22株(62.9%)至少攜帶一種β-內酰胺酶基因，CTX-M(593 bp)和TEM基因的攜帶率分別為54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，其中CTX-M-1G(1 018 bp)和CTX-M-9G(870 bp)基因攜帶率分別為40.0%(14/35)和28.6%(10/35)，5株同時檢測到CTX-M-1G和CTX-M-9G基因，9株同時攜帶CTX-M和TEM基因(表3)，未檢測到CTX-M-2G和SHV基因。

M, DNA標記DL 2 000; N, 陰性對照; 1, 陽性對照; 2和3, 大腸桿菌分離株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, positive control; 2 and 3, E.coli isolates圖4 大腸桿菌分離株β-內酰胺酶基因擴增Fig.4 Amplification of β-lactamase genes of E.coli isolates by PCR

表3 35株產ESBL菌株的β-內酰胺酶基因分型Table 3 Genotyping of β-lactamase gene of the 35 ESBL-producing isolates

3 討論與結論

3.1 寵物源大腸桿菌的耐藥情況

伴侶動物耐藥菌的產生和流行受到國內外的廣泛關注[9-13,21-23]。近年來從寵物中分離出越來越多的多重耐藥大腸桿菌，這些菌攜帶的耐藥基因可在人類和動物之間進行水平傳播[22]。成年犬、貓感染致病性大腸桿菌可導致腎盂腎炎和尿道炎，患病犬、貓與人類接觸可導致人類發生尿路感染[23]?；趯櫸锱c人類的親密關系，不僅國外重視研究寵物源大腸桿菌的耐藥問題，在我國也有多個地區開展了針對寵物源大腸桿菌的耐藥性研究，包括吉林、成都、廣州和石河子等[9-12]，大量的研究發現寵物攜帶有大量的耐藥菌，但新疆地區關于此相關研究報道相對較少，因此，本研究對烏魯木齊市寵物源大腸桿菌進行耐藥性研究具有重要意義。

本研究中寵物源大腸桿菌分離株對早期使用較多的抗生素如四環素和氨芐西林的耐藥較為嚴重，與吉林、石河子、廣州地區所報道的寵物源大腸桿菌的耐藥率相似均在50%以上[9,12-13]。這些分離株對臨床常見抗生素，如復方新諾明、哌拉西林、頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素等也存在不同程度耐藥。在同一類型的抗生素中，如鏈霉素(27.5%)和阿米卡星(7.5%)的耐藥率也存在一定差異。這種情況可能與臨床寵物醫生抗生素用藥習慣及用藥頻率有關。

本研究發現寵物源大腸桿菌對四環素、氨芐西林、頭孢噻肟和環丙沙星的耐藥率分別為60.8%、51.7%、29.2%和14.2%，均低于國內其他地區[9,12]。根據寵物醫院用藥情況發現，目前寵物適用的抗生素種類較多，促使大部分臨床寵物醫生在用藥方面有更多的選擇權。國外的研究結果顯示，澳大利亞寵物源大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率最高為9.3%，美國寵物源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高達23%；葡萄牙健康犬源大腸桿菌對四環素的耐藥率最高為20%[24-26]。與國外相比，烏魯木齊市寵物源大腸桿菌的耐藥率更高，多重耐藥情況更嚴重。此外，從健康和患病寵物中均分離到多重耐藥大腸桿菌，與健康寵物相比，患病寵物大腸桿菌的耐藥譜型更豐富，寵物臨床上應重視監測大腸桿菌的耐藥性，慎用耐藥率高的抗生素。

3.2 寵物源大腸桿菌ESBLs耐藥基因的攜帶情況

超廣譜頭孢菌素，尤其是第三和第四代頭孢菌素，被世界衛生組織和世界動物衛生組織列為對人類和動物極為重要的抗菌藥物[27]。大腸桿菌主要通過產生ESBLs實現對超廣譜頭孢菌素耐藥[4]。在本研究中發現29.2%寵物源大腸桿菌為產ESBLs菌株，高于國內楊守深等[11]對廣州寵物的研究結果。本研究在35株耐頭孢噻肟的菌株中檢測到CTX-M和TEM型ESBLs，檢測率分別為 54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，以CTX-M型ESBLs為主，且包含CTX-M-1G(40.0%)和CTX-M-9G(28.6%)，這與國內外的研究結果一致[24,28]。13株產ESBL菌株未檢測到CTX-M、TEM和SHV，表明這些菌株可能攜帶其他酶，降低了對三代頭孢菌素的敏感性[8]。

碳青霉烯類抗菌藥物是治療革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”。值得注意的是，在藥敏試驗中，發現有9.2%的寵物源大腸桿菌分離株對亞胺培南耐藥，而且在1只幼齡布偶貓體檢的肛拭子中分離到1株對美羅培南和亞胺培南同時耐藥的菌株，這些菌株的耐藥基因有待進一步研究。

綜上所述，烏魯木齊市寵物源大腸桿菌對臨床常用抗生素的耐藥率在10.0%～60.8%，并出現了對碳青霉烯類耐藥的菌株，提示該地區寵物源大腸桿菌耐藥情況嚴重，應重視產ESBLs大腸桿菌在寵物中流行的嚴峻形勢，慎用耐藥率高的抗生素，對防止耐藥基因在大腸桿菌中的廣泛播散具有重要意義。