牛骨膠原蛋白肽制備工藝優化及抗氧化活性分析

魏潔瓊，余群力，韓玲，韓廣星，張新軍，曹暉，羅小嬋

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東 臨沂 276000；3.寧夏夏華肉食品有限公司，寧夏 中衛 751700；4.陜西秦寶牧業股份有限公司，陜西 寶雞 721000)

膠原蛋白是由動物細胞合成的一種生物性高分子[1]，是維持正常組織構造和性能的必要成分[2]，具有良好的生物化學和生物相容性[3].膠原蛋白肽是膠原蛋白在一定的外部條件下發生水解后得到的產物，與膠原蛋白相比食用后利用率較高，易被人體吸收.國內外許多研究表明，膠原蛋白肽可能有助于預防老年動脈粥樣硬化[4]，促進成骨細胞的生長[3]，長期攝入可能改變消化道的外型或內型蛋白酶活性，從而有益身體健康[5].

隨著我國肉牛養殖的集約化和肉類加工業的發展，肉牛屠宰加工副產物也隨之增加，牛骨是其中主要的副產物之一，其含有豐富的蛋白質、礦物質、脂肪等營養成分，其中膠原蛋白為骨源蛋白質的主要成分[6].因此，從牛骨中提取膠原蛋白并進一步制備成膠原蛋白肽，是一個具有開發潛力的科技成果轉化途徑，且綜合利用骨副產物不僅可以減少環境污染，還具有很高的經濟和社會效益[7].

目前國內外已有不少關于膠原蛋白肽功能特性的研究報道：雞胸骨膠原蛋白肽具有抗氧化、抗炎和抑制軟骨細胞凋亡的作用[8]；阿拉斯加鱈皮膠原蛋白肽對燒傷后小鼠的腸道緊密連接有保護作用[9]；超濾法分離得到分子量小于3 ku的豬骨膠原多肽原溶液，其蛋白質濃度最低，但ACE抑制率最高[10].李嬌嬌[11]采用復合風味蛋白酶和木瓜蛋白酶優化鵝骨抗氧化肽的制備工藝并對其分離純化，得到了小于5 ku的鵝骨抗氧化肽，該肽具有很高的超氧陰離子自由基清除能力.張康華等[12]采用雙酶分步酶解制備的豬皮膠原蛋白肽在體內外均有不同程度的抗氧化能力，且分子量越小抗氧化活性越強.通過對前人研究的總結發現，目前關于牛骨膠原蛋白肽的提取及不同分子量肽組分抗氧化性的報道還相對較少.因此，本研究以牛骨為原料，篩選酶解效果最優的酶，對酶添加量、酶解時間、pH值、酶解溫度進行單因素試驗，并在此基礎上優選試驗因素，利用響應面設計試驗得出牛膠原蛋白肽的最佳提取條件，并對不同分子量的肽組分的抗氧化活性進行研究，以期使現有的牛骨資源得到充分利用，變廢為寶，為牛骨產品的深度開發提供理論基礎和技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑 牛骨原料采購于寧夏夏華肉食品有限公司，隨機選取發育正常、健康無病的牛腿骨，剔除筋肉等，切成塊狀于-80 ℃冷凍貯存.

2,2-聯苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)，上海麥克林生化科技有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，日本Solarbio公司；其他試劑均為國產分析純.

1.1.2 儀器與設備 LHS-150SC電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司；FA1-204B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；pHS-3C酸度計，德國儀表有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度儀，上海光譜儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 骨膠原蛋白肽制備的工藝流程 牛骨→脫脂→脫鈣→酸溶酶法提取膠原蛋白→酶解→超濾分段→凍干→多肽.

1.2.2 酶的篩選 分別在同等酶添加量3%和同等酶活力10 000 U/g條件下對膠原溶液進行酶解，以多肽提取率為指標，選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各自理論最適條件下進行酶解，通過對比優選效果最佳的酶.

稱取牛骨膠原蛋白用磷酸鹽緩沖液溶解配制成80 g/L的膠原溶液作為底物.按照試驗設計調節恒溫水浴鍋至各自理論最適溫度，加入酸或堿調節溶液pH值至各自理論最適pH值，加入酶進行酶解.酶解到達預定時間后，沸水浴滅酶5 min終止反應，迅速冷卻至室溫后，以4 000 r/min離心15 min，取上清液備用.

表1 各種酶的最適條件

1.2.3 酶解單因素試驗 堿性蛋白酶在骨膠原蛋白質量濃度80 g/L、酶解溫度50 ℃、pH 9.0、酶添加量3.0%、酶解時間4 h的條件下，設置酶添加量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%)、酶解時間(2、3、4、5、6、7 h)、pH值(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)為因素，改變其中一個因素，保持其他因素不變，以多肽提取率為指標進行單因素試驗.

1.2.4 響應面試驗 根據單因素試驗結果，選取酶添加量(A)、酶解時間(B)、pH值(C)、酶解溫度(D)為影響因素，以多肽提取率為響應值進行4因素3水平的響應面分析試驗.

表2 Box-Behnken試驗因素與水平

1.2.5 多肽提取率的測定 參考程妍[13]的方法略作修改.

1.2.6 多肽分子量分段 使用裝有截留分子量為10、3 ku超濾膜的Amicon-Ultra-15超濾離心管對骨膠原蛋白酶解液進行分離，離心機轉速為6 500 r/min，離心時間40 min.分別收集3個組分：分子量大于10 ku的組分Ⅰ、分子量在3～10 ku范圍內的組分Ⅱ以及分子量小于3 ku的組分Ⅲ，將所得的各個組分冷凍干燥.

1.2.7 抗氧化性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考劉倩霞等[14]方法并略作調整.以95%乙醇溶解DPPH，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液.將2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液于漩渦震蕩儀混合均勻，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度.按下列公式計算：

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度，Ao為2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度.

1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用ALI、Li X C等[15-16]的方法，略有改動.取樣品溶液0.2 mL與5.6 mL 0.05 mol/L Tris-Hcl緩沖液(pH 8.2)混勻后，再加入0.1 mL鄰苯三酚溶液(用0.01 mol/L HCl配制成0.003 mol/L，25 ℃水浴預熱)于漩渦振蕩儀反應30 s后，在325 nm波長處測定30 s時的吸光度A1，300 s時的吸光度A2；蒸餾水取代樣品溶液作空白組.用5.6 mL Tris-Hcl緩沖液、0.2 mL蒸餾水和0.2 mL 0.01 mol/L HCl的混合液調零.按下列公式計算：

式中：ΔAs=A2-A1；ΔA0為空白組吸光度.

1.2.7.3 羥自由基清除能力的測定 參照李嬌嬌[11]方法，取9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各1 mL，在反應體系中加入1 mL樣品溶液，加入l mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37℃保溫30 min.空白組加入1mL蒸餾水替換同體積的樣品溶液.以蒸餾水為參比液，在510 nm下測定吸光值.按下列公式計算：

式中：Ao為空白對照液的吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；ΔAxo為酶解液的本底吸光度.

1.2.7.4 還原力的測定 參考Gu F L等[17]的方法.取1 mL樣品，與2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，依次加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液、2.5 mL蒸餾水，室溫下靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度.樣品的吸光值越大，說明其還原能力越強.

1.3 數據處理

上述測定至少重復3次試驗，數據使用Microsoft Excel 2010軟件整理，采用SPSS 21.0軟件進行統計和方差分析.

2 結果與分析

2.1 酶的篩選

由圖1可知，不同蛋白酶對骨膠原蛋白的酶解效果差異顯著，這可能由于不同蛋白酶作用位點不同.經過方差顯著性分析表明，在相同酶濃度和相同酶活力條件下，堿性蛋白酶的多肽提取率均較高.因此認為，堿性蛋白酶為骨膠原蛋白肽制備過程中酶解效果最優的酶.

不同小寫字母代表差異顯著性(P<0.05).The different small letters show significant difference(P<0.05).圖1 各蛋白酶酶解效果比較Figure 1 Enzymatic effects of different kinds of enzymes

2.2 單因素試驗結果

由圖2-A可見，堿性蛋白酶在酶添加量為3%時達到最大值15.11%，多肽提取率高于或低于3%均有下降.這可能是由于在底物濃度足夠的條件下，適宜的酶和底物能夠充分結合、反應完全，所以在一定的水解時間內，多肽提取率也隨之增加.當酶添加超量時，超量部分酶無法與底物結合，且可能對反應產生抑制作用.

如圖2-B所示，在酶解2～5 h內，多肽提取率隨時間的延長而增加，6 h時多肽提取率最大，達到了6.88%，但與5 h 時多肽提取率6.68%相比差異不顯著，并逐漸趨于穩定.為節省成本，酶解時間為5 h較為適宜.

由圖2-C可知，當水解液pH值在7.5～9.0范圍內，多肽提取率隨pH的增大而增大(P<0.05)，pH 9.0時達最大值7.86%；隨著pH值的不斷增大，多肽提取率開始下降.這可能是不適宜的環境導致酶的空間構造發生變化，使部分酶活性降低所致.

圖2-D表明，當溫度在30～45 ℃范圍，多肽提取率隨溫度的上升而增大(P<0.05)，在50 ℃時達最大值11.71%之后；隨著溫度的逐漸升高，多肽提取率開始下降.這可能是由于溫度升高使酶發生了部分變性，從而抑制了反應的進行.

圖2 單因素試驗結果Figure 2 Results of single factor experiments

2.3 響應面試驗結果

利用Design-Expert 8.0設計軟件，采用Box-Behnken設計試驗方案，對酶解工藝參數進行優化.結果見表3，由此獲得二次回歸方程：

多肽提取率/%=12.76+0.12A+0.100B+0.002C+0.15D-0.20AB-0.13AC+0.11AD-0.11BC+0.50BD+0.22CD-1.154A2-1.18B2-1.30C2-1.22D2

表3 堿性蛋白酶響應面試驗設計及結果

表4 堿性蛋白酶二次回歸方程模型方差分析

綜合單因素及響應面試驗結果，得到堿性蛋白酶制備骨膠原蛋白肽的優化工藝參數為酶添加量3.03%、酶解時間5.01 h、pH值9.0、酶解溫度50.35 ℃，預測多肽提取率為12.76%.為使實際應用過程中操作方便，將工藝參數修正為酶添加量3.0%、酶解時間5.0 h、pH值9.0、酶解溫度50.4℃，在此條件下得到多肽提取率為12.45%，實際值與理論值基本相符，說明模型對堿性蛋白酶酶解骨膠原蛋白工藝參數優化可行，具有一定的實用價值.

2.4 抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，所有組分清除DPPH自由基的能力隨著各自濃度的升高而增強.在濃度為5 mg/mL時，DPPH自由基抑制順序為：組分Ⅲ>組分Ⅱ>組分Ⅰ>酶解液，清除率分別為(48.90±1.73)%，(44.99±1.47)%，(38.56±1.59)%和(25.52±1.19)%.結果表明，所有分級組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)均比酶解液具有更高的清除率，且分子量越小DPPH自由基清除能力越好.

不同大寫字母代表組內差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖3 不同分子量對DPPH自由基清除能力的影響Figure 3 Effects of DPPH radical scavenging activity of different molecular weights

DPPH是一種穩定的自由基，其醇溶液呈深紫色，當其遇到提供質子的底物(如抗氧化劑)時，自由基被清除并且吸收率降低[18]，從而使溶液顏色從深紫色變為黃色，接受電子或氫原子成為穩定的抗磁性分子[19].試驗結果表明，牛骨膠原蛋白肽具有較強的清除DPPH的能力.

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子是人體內產生的一種活性氧自由基，過多的超氧陰離子將會損傷細胞、破壞人類機體生理功能[20].由圖5可見，超氧陰離子的清除能力隨著濃度的升高而增大，與其他抗氧化指標相同，在組分Ⅲ(M<3 ku)時具有最好清除效果.結果表明，水解產物分級的超氧陰離子清除率值明顯高于原始酶解液，組分Ⅲ具有比組分Ⅰ和組分Ⅱ更好的清除能力.當濃度為5 mg/mL時，組分Ⅲ的超氧陰離子清除率高達(51.13±1.63)%，其次是組分Ⅱ(45.94±1.53)%和組分Ⅰ(42.503±1.56)%.結果表明，牛骨多肽的抗氧化活性與其濃度和分子量均密切相關.

不同大寫字母代表組內差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖4 不同分子量對超氧陰離子自由基清除能力的影響Figure 4 Effects of superoxide anion radical activity of different molecular weights

2.4.3 羥自由基清除能力 活性氧自由基是不穩定的，易與體內的其他基團或物質發生反應，導致細胞損傷，甚至導致疾病[21].因此，去除羥基自由基可能是一個生物體對各種疾病最有效的防御之一.由圖5可知，牛骨多肽對羥自由基的清除能力呈濃度依賴性，隨著濃度的增大，其清除能力呈上升趨勢.試驗結果顯示，各組分對羥自由基影響順序為：組分Ⅲ>組分>Ⅱ組分Ⅰ>酶解液，并且表明不同分子量牛骨多肽對羥自由基清除存在量效關系.多肽濃度為 5 mg/mL 時，各組分的清除率達到最高，分別為(87.31±1.76)%、(85.83±1.41)%、(82.51±0.93)%、(70.86±1.08)%.

不同大寫字母代表組內差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖5 不同分子量對羥自由基清除能力的影響Figure 5 Effects of Hydroxyl radical scavenging activity of different molecular weights

2.4.4 還原力 還原力測定通常用于評估天然抗氧化劑提供電子或氫的能力，與其抗氧化性呈正相關[22].由圖6可知，多肽濃度越高，還原力越大，抗氧化能力越強.酶解液在0.1 mg/mL時吸光度為0.099，5.0 mg/mL時為0.112，增大了11.6%，組分Ⅲ在0.1 mg/mL時吸光度為0.119，5.0 mg/mL達到0.142，增大了16.2%.在相同多肽濃度下，組分Ⅲ的增加趨勢顯著優于酶解液.酶解后的產物能夠提高還原力是由于其中存在的抗氧化肽能夠將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+，并進一步生成普魯士藍，通過測定700 nm處的吸光度可間接反映出水解物的還原能力[23].

不同大寫字母代表組內差異顯著;不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖6 不同分子量對還原力的影響Figure 6 Effects of Reducing power of different molecular weight

3 討論

牛骨膠原蛋白肽制備過程受酶添加量、酶解時間、pH值、酶解溫度等因素的影響，在一定的條件范圍內，肽提取率會隨影響因素的變化而變化.本研究中肽提取率隨酶添加量的增加呈先增高后降低的趨勢，這與朱瀛等[24]研究的木瓜蛋白酶水解雞骨泥制備短肽中結果相似，可能原因是在底物濃度足夠的條件下，適宜的酶和底物能夠充分結合、反應完全，所以在一定時間內，肽提取率也隨之增加；當酶添加超量時，超量部分酶無法與底物結合，且可能對反應產生抑制作用.試驗中隨著酶解時間的延長，肽提取率呈先升高后逐漸穩定的趨勢，這可能由于在酶解初期，暴露的酶切位點較多，利于水解反應的進行，使得肽提取率升高，但隨著酶解時間的延長，可供酶切的位點減少，不能有效地促進酶與底物的結合，導致水解反應放緩[14].試驗中酶解溫度的升高使得肽提取率先上升后下降，此結果與徐榮榮等[25]研究的超聲波輔助酶法水解酪蛋白工藝優化結果相似，這可能由于酶解溫度升高，酶作用位點釋放，加速了底物蛋白和酶的反應，促進水解進程，使肽片段暴露；當溫度繼續升高使得酶的活性中心發生構象的改變，酶被破壞[26]，肽提取率下降.試驗中隨著pH值的增大，肽提取率隨之先增加后緩慢降低，這可能是不適宜的環境導致酶的空間結構發生改變，使部分酶活性降低.本試驗在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計響應面試驗得到最佳酶解條件為酶添加量3%、酶解時間5 h、pH 9.0、酶解溫度50.4℃，該條件下進行酶解驗證得到提取率為12.45%，結果較優化之前顯著提高，說明堿性蛋白酶可有效酶解骨膠原蛋白，且該方法簡單易操作，成本低廉，有利于骨資源的合理利用.

本試驗通過對DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力的測定，評價各組分肽的抗氧化活性，分析了不同分子量肽段的抗氧化活性.結果表明，不同分子量的肽段均對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基具有良好的清除能力，并有較強的還原能力.其中DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除活性與徐兆剛等[27]研究的河蚌蛋白抗氧化肽相比較弱，這可能是因為原料和酶種類的不同造成所提取的物質濃度不同，從而影響其抗氧化活性；羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力與張康華等[12]提取的豬皮膠原肽清除能力相當，但DPPH自由基清除率相對較弱，這可能由于雙酶酶解得到的膠原肽分子量更小，具有更好的DPPH自由基清除活性.還原力與葛曉鳴[28]等研究的海馬酶解多肽還原力一致，分子量愈小還原力愈大.由此可見，骨膠原蛋白多肽具有一定的抗氧化活性，目前提取的膠原蛋白肽是多種肽的混合物，今后需對其分離、純化及活性進行深入研究.

4 結論

1) 優選得到具有最佳酶解效果的堿性蛋白酶，其酶解工藝條件為：酶添加量3%、酶解時間5 h、pH 9.0、酶解溫度50.4 ℃，在此條件下膠原蛋白肽提取率為12.45%，結果較優化之前顯著提高.

2) 超濾得到的3種不同分子量的肽組分均具有抗氧化活性，其中組分Ⅲ(M<3 ku)的抗氧化活性最強，組分Ⅱ(10 ku10 ku)最弱.

3) 本研究既充分利用了牛骨中的蛋白質資源，也為肉牛屠宰加工副產物牛骨的精深加工提供了新思路和新方法.