基于琥珀酸二鈉的鮮味相互作用及呈味基料的研究

馬杰，周希瑞，魏軒，陳艷萍，陳高樂，劉源

（上海交通大學農業與生物學院，上海200240）

基本味覺包括酸、甜、苦、咸、鮮5種，其中鮮味作為第5種基本味覺，是由鮮味物質與受體結合產生的味覺感受[1-2]。根據化學結構的差異性，鮮味物質可分為氨基酸及其鹽類、核苷酸類、有機酸類、肽類等[3-4]。琥珀酸及其鈉鹽作為有機酸類，被認定屬于鮮味物質[5]。琥珀酸二鈉（disodium succinate，WSA）俗稱干貝素，呈鮮閾值為0.03%[6]，是貝類、蝦、蟹等海產品及香菇中的重要鮮味物質[7-8]，是我國食品添加劑國家標準唯一批準使用的有機酸類鮮味物質[9]。食品中富含種類不同的鮮味物質，它們均可引發鮮味，肉類、魚類等食物以及調味品呈現的特殊鮮美滋味是多種鮮味物質相互作用的結果。

關于鮮味物質相互作用的研究多集中在氨基酸類和核苷酸類之間，主要是谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）與肌苷酸二鈉（inosinate monophos－phate disodium salt，IMP）、鳥苷酸二鈉（guanosine monophosphate disodium salt，GMP）的相互作用。針對有機酸類鮮味物質與其他鮮味物質的相互作用研究較少，且相互作用的研究多以食物為研究對象，僅從滋味對食物整體貢獻度方面進行了解釋，并沒有對鮮味物質之間的相互作用規律進行深入研究。另一方面，近年來，養殖暗紋東方鲀在加工過程中會產生大量的副產物如魚頭、魚骨等，這些副產物可以酶解后進行美拉德反應制備呈味基料。因此，這些河鲀魚副產物可以作為呈味基料的原材料而被充分利用，從而提高其經濟附加值。

針對鮮味物質相互作用的定量研究，感官評定是最直接、有效的方法，其中，兩點強迫選擇性檢驗法（2-alternative forced choice，2-AFC）培訓過程相對簡單，且已被廣泛用于甜味強度的定量研究。時間-強度法（time intensity，TI）作為一種動態感官方法，能夠有效反映滋味物質的感官屬性在口腔中的動態變化[10-11]?；诖?，本試驗擬采用WSA為研究對象，利用感官試驗中的2-AFC法和動態感官TI法對WSA與市面上常用的鮮味劑呈味核苷酸二鈉（disodium ribonucleotide，I+G）、酵母抽提物（yeast extract，YE）相互作用的規律進行研究，并且結合相互作用規律開發基于河鲀魚副產物的新型呈味基料。該研究可為其他二元鮮味物質互作及新型鮮味劑開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琥珀酸二鈉（純度＞98.0%）、肌苷酸二鈉（純度為98.0%）：上?？蚂`斯試劑有限公司；鳥苷酸二鈉（純度為98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；I+G為GMP和IMP按照1∶1（質量比）混合得到；酵母抽提物0203型（基礎型，鮮味一般，主要為厚味）：思賓格公司；復合蛋白酶（食品級，活性≥90 U/mg，St.Louis，MO，USA）：Sigma Chemicals；D-（+）-木糖（BR，≥98.5%）、L-半胱氨酸（≥98.5%，BR）：國藥化學試劑有限公司。養殖暗紋東方鲀（2年，每條魚質量約為200 g～300 g）：大連天正實業有限公司；試驗用水均為Milli-Q系統制備的超純水；所有樣品均控制在室溫條件（23±2）℃。

1.2 儀器與設備

IKA-A11BS025分析研磨機、T-25高速分散機：德國IKA公司；真空冷凍干燥機-Alpha 1-2 LDplus：德國Christ公司；馬爾文Kinexus旋轉流變儀-Ultra+：英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 琥珀酸二鈉與呈味核苷酸二鈉（I+G）和酵母抽提物（YE）相互作用研究

1.3.1 專業感官員篩選與培訓

根據“ISO 8586：2012 Sensory analysis-General guidelines for the selection，training and monitoring of selected assessors and expert sensory assessors”的標準，從上海交通大學招募了60名志愿者。最終經過篩選和培訓，建立了穩定在24人的感官評價小組（15名女性和9名男性，年齡在21歲～36歲之間）。

參考“ISO-5495：2005 Sensory analysis-Methodology-Paired comparison test”的標準，對24名感官員進行2-AFC培訓。時間-強度法參考ASTM E1909-13（2017）《Standard Guide for Time-Intensity Evaluation of Sensory Attributes》[12]，試驗中的鮮味強度值通過標準化設計的坐標軸紙進行收集，坐標橫軸代表時間（s），縱軸代表鮮味強度標度值，以長度單位（mm）表示。計時過程由試驗員統一進行。

1.3.2 基于2-AFC的琥珀酸二鈉與I+G和YE相互作用探究

在該試驗階段使用樣品為WSA與I+G混合溶液、WSA與YE混合溶液。WSA濃度為0.35%（該濃度能提供適中鮮味），YE則為5個濃度梯度（0.005%、0.05%、0.5%、1%、2%）；同樣，I+G也設置5個濃度梯度（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%）分別與 WSA（0.35%）進行復配。選用24名經過培訓的專業感官員，向他們每次提供3對樣品。每對樣品由復配溶液和一個MSG溶液（10 mL）組成，每對樣品以平衡隨機順序呈現給感官員。對于每對樣品，感官員需要根據感知到的鮮味強度選出鮮味較強的樣品并記下編碼。樣品與樣品品嘗之間，感官員需要用超純水充分漱口2次～3次，并休息2 min。

1.3.3 基于時間-強度法（TI）的琥珀酸二鈉與I+G和YE相互作用探究

選用8名經過培訓的專業感官員，基于1.3.2中的試驗結果選用WSA∶I+G=0.35% ∶0.4%、WSA∶YE=0.35% ∶0.5%的復配溶液及 WSA（0.35%）、（I+G）（0.4%）、YE（0.5%）單一溶液作為待測樣品。在試驗員計時口令發出時（0 s），感官員立即品嘗樣品并充分感受其鮮味，隨后在5、10、20、30、45、50、60、70、80、90、100 s指令發出時，分別在坐標紙上標出感受到的鮮味強度值，其中40 s指令發出時立即將樣品吐出，之后感官員對口腔中殘留的鮮味進行打分。樣品與樣品之間至少休息2 min，并用超純水充分漱口2次～3次，每個樣品重復測定3次[13-14]。

1.4 呈味基料制備與特性測定

1.4.1 河鲀魚副產物制備

根據SC/T 3033-2016《養殖暗紋東方鲀鮮、凍品加工操作規范》對暗紋東方鲀進行處理，收集魚頭和魚骨放于-80℃冰箱貯存備用。為了使河鲀內源酶失活，將收集的副產物放于燒杯中在85℃循環水浴下煮制20 min，冷卻至室溫（23±2）℃后，將魚頭、魚骨使用研磨機對其進行粉碎處理。將粉碎后的樣品包裝在鋁箔袋并于-20℃下儲存備用[15]。

1.4.2 蛋白水解物制備

在復合蛋白酶水解之前，將收集的河鲀魚副產物在4℃冰箱中過夜解凍14 h。按照超純水與河鲀副產物粉末樣品4∶1（質量比）的比例加水溶解。為了更充分溶解，通過T-25高速分散機進行勻漿處理。復合蛋白酶水解條件為47.7℃[16]，pH 6.1（使用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl進行調節）5 h[超純水∶副產物∶復合蛋白酶=400∶100∶2.6（質量比）]。然后，將得到的酶水解產物在95℃下滅活15 min。將產物冷卻至室溫（23±2）℃，隨后在25℃下，對酶水解產物進行15min7000g離心，收集上清液。冷凍干燥所得清液，收集河鲀魚復合蛋白酶解物粉末（takifugu obscurus by-products protein hydrolysate，TBPH）并將其儲存在-20 ℃冰箱備用[16-17]。

1.4.3 美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）的制備

美拉德反應產物的制備參考Wang等[18-20]的方法。制備10 mL反應體系（TBPH0.5 g、木糖0.2 g、半胱氨酸0.15 g、純水10 mL）于試管中，然后將樣品在pH 7.4，120℃金屬浴下加熱2 h進行美拉德反應，冷卻至室溫（23±2）℃。然后真空冷凍干燥收集粉末并稱重，將美拉德反應產物粉末（MRPs）儲存在-20℃冰箱備用。

1.4.4 美拉德反應產物（MRPs）適宜濃度的選取

6名已培訓過的專業感官員進行該步驟的感官試驗。為了使MRPs鮮味更好地體現，需要選取適當的鮮味基質溶液，參照Ogasawara等[19]的研究結果，選擇MSG-NaCl（0.3%∶0.1%）作為基質溶液的最佳比例。配置濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRPs溶液于基質溶液中，要求感官員對其進行鮮味強度打分。鮮味強度打分在100 mm的坐標軸紙上進行收集[21]，標度最左端定義為“感受不到鮮味”，標度最右端定義為“鮮味極其強烈”。每個樣品重復測定3次。

1.4.5 一元/二元鮮味物質與美拉德反應產物（MRPs）混合溶液鮮味強度測定

根據1.4.4的試驗結果，選用0.1%MRPs與NaCl（0.3%）以體積比1∶1混合，作為該步驟中混合溶液的基質溶液。在基質溶液中分別加入WSA∶I+G（0.35%∶0.4%）和 WSA ∶YE（0.35% ∶0.5%）兩個二元相互作用組合，以及0.3%MSG，以檢測WSA、I+G和YE，以及MSG對MRPs混合溶液的鮮味提升作用。

使用10名已培訓過的專業感官員對混合溶液進行鮮味強度打分。其他感官評定的步驟同1.4.4。

1.4.6 美拉德反應產物（MRPs）混合溶液的流變特性測定

流變特性的測定利用馬爾文Kinexus旋轉流變儀-Ultra+，以黏度為測定指標。選用以圓筒為夾具的流變儀測定混合溶液樣品的黏度，圓筒尺寸為PC14 C0009 SS。測定時的剪切速率設定為（0.1 s-1～50 s-1）。測量前樣品先平衡靜置5 min，選用穩態掃描模式，溫度為25℃，設定變量每增加10倍取5個點，每個樣品做兩次平行[22]。

1.5 數據分析

對于2-AFC試驗的結果，感官員的選擇率表示為“谷氨酸鈉樣品更鮮”的人所占的百分比。通過選擇率對谷氨酸鈉濃度作圖，線性回歸擬合直線用于確定50%選擇率對應的MSG濃度，這被認為是該樣品的相對鮮味強度[23]。

時間-強度數據結果使用每一個時間節點下的強度分值的平均值表示。數據顯著性采用SPSS（IBM SPSS Statistics 24）分析。針對TI特征參數——最大強度Tmax，采取單因子方差分析（One-Way ANOVA）。

混合溶液鮮味強度的分值測定用每一個混合樣品濃度下感官員3次測量的平均值表示，整體數據顯著性采用SPSS（IBM SPSS Statistics24）進行分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 基于2-AFC的琥珀酸二鈉與I+G鮮味相互作用結果

不同混合溶液在特定濃度下的擬合曲線見圖1。

由圖1可知，各擬合曲線50%選擇率對應的MSG濃度即為該樣品的相對鮮味強度。計算結果見表1。

由表1可知，混合溶液的相對鮮味強度先增大后減小。在I+G濃度為0.4%時，混合溶液的相對鮮味強度達到最大，為0.520%MSG。推測是在該濃度下，呈味核苷酸二鈉解離出足夠多的Na+與WSA產生了相互作用，最大程度地增強了鮮味，這與鮮味的產生機理是一致的，即鮮味的發揮需要一定量的Na+包圍陰離子[4]。而當I+G超過一定濃度時，鮮味強度下降可能是由于IMP濃度過高時，本身所產生的澀味對鮮味強度有抑制作用，這與陳繼蘭等[24]的研究結果一致。

圖1 WSA和I+G混合溶液相對鮮味強度擬合曲線Fig.1 Relative umami intensity curve of WSA and I+G mixed solution

表1 I+G與WSA復配后相對鮮味強度測定Table 1 Relative umami intensity of mixed I+G and WSA

2.2 基于2-AFC的琥珀酸二鈉與YE鮮味相互作用結果

WSA與不同濃度YE混合的擬合曲線見圖2。

圖2 WSA和YE混合溶液相對鮮味強度Fig.2 Relative umami intensity curve of WSA and YE mixed solution

由圖2可知，各擬合曲線50%選擇率對應的MSG濃度即為該混合溶液的相對鮮味強度。計算結果見表2。

表2 YE與WSA復配后相對鮮味強度測定Table 2 Relative Umami intensity of mixed solutions with YE and WSA

由表2可知，混合溶液的鮮味強度逐漸增大，但當YE超過0.5%時，相對鮮味強度基本維持在0.3%MSG左右，并且混合溶液出現了酸味和澀味而不被感官員所接受，這與劉建彬等[25]的研究一致。此外，劉通訊等[26]研究發現，當YE添加濃度為0.2%時，對醬油鮮味改善不明顯，當添加濃度0.5%、0.8%、1.0%均能較好地改善醬油風味，但整體差距不大。

由表2滋味描述結果可知，WSA與YE混合溶液達到較強的鮮味強度且不致產生酸、澀味的濃度為0.35%∶0.5%。YE本身就是一種復雜的體系，富含多種氨基酸，微量元素及谷胱甘肽、鳥苷、肌苷等[27]，本文的研究把YE看作一元鮮味物質，相對WSA與I+G的混合溶液，該混合溶液并沒有對鮮味有較大的提升，這可能與YE本身較弱的鮮味有關，由于YE體系的復雜性，其本身含有的其他物質可能對鮮味感知有影響。

2.3 基于時間-強度法（TI）的琥珀酸二鈉與I+G和YE鮮味相互作用結果

二元混合溶液及單一組分溶液的時間-鮮味強度曲線見圖3。

由圖3可知，在0～100 s計時范圍內，7個樣品表現出相似的時間特性，即在0～5 s內，鮮味強度逐漸增大，在5 s左右達到最大鮮味強度，然后5 s～100 s內，鮮味強度逐漸降低。這與Giovanni等[28]的研究結果一致，即0 s至200 s內，鮮味強度因在口腔中被感知而增大，后因溶液被吞咽或者被吐出，鮮味逐漸減弱。

對時間強度曲線中的特征參數（最大鮮味強度）提取分析，各樣品時間強度曲線中最大鮮味強度如圖4所示。

由圖4可知，樣品對最大鮮味強度有顯著性影響（p＜0.000 1）。0.35%WSA與0.4%I+G的混合溶液呈現最強鮮度，且比單一0.4%I+G、0.5%YE、0.35%WSA鮮味強（相對應的 p＜0.000 1，p＜0.000 1，p＜0.00 1），這與之前2-AFC的鮮味強度結果一致。由圖3可知，在吐前（0～30 s）和吐后（45 s～100 s）鮮味在不同樣品中呈現不同的趨勢。因此，分別對吐前和吐后溶液鮮味強度變化進行分析，混合溶液及單一溶液吐前、吐后TI曲線如圖5和圖6所示。

圖5 WSA和I+G混合溶液及單一溶液TI曲線圖Fig.5 TI curve of WSA and I+G mixed solution and single solution

由圖 5可知，在吐前（0～30 s），0.35%WSA 與 0.4%I+G的混合溶液鮮味強度顯著比單一WSA強（p=0.012），且比單一I+G強（p=0.014）。這說明它們之間對鮮味的影響作用具有雙向性，即往0.35%WSA中加入0.4%I+G，可以增強0.35%WSA的鮮味強度，0.35%WSA的加入同樣可以增強0.4%I+G的鮮味。在溶液吐出之后（45 s～100 s），WSA與I+G的混合溶液鮮味強度顯著比單一WSA強（p=0.014），但混合溶液的鮮味與單一I+G所引起的鮮味沒有差異（p=0.73），即吐后，它們對口腔中殘留鮮味強度的相互作用具有一定方向性。

圖6 WSA和YE混合溶液及單一溶液TI曲線圖Fig.6 TI curve of WSA and YE mixed solution and single solution

綜合上述結果可以發現，WSA和I+G對即時鮮味強度和殘留鮮味強度是有不同影響的。文獻表明I+G作為核苷酸類鮮味物質，在鮮味上具有直沖感和先覺感，而WSA可以將食品的先覺感和后覺感連在一起[6]，它們的結合不僅增強品嘗時的鮮味，且對殘留鮮味也有增強效果。閻微等[29]發現IMP、GMP在不同食品體系中的增鮮效果不同，IMP在增鮮及適口性上具有較好效果，而GMP在增鮮及滯留感上具有較好效果，這一結果與本文研究結果一致。

同樣針對0.35%WSA與0.5%YE的混合溶液以及單一溶液進行吐前和吐后鮮味強度變化分析。由圖6可知，在吐前（0～30 s），WSA 與 YE 混合溶液的鮮味強度比單一YE強（p=0.018），但與單一WSA溶液之間沒有差異（p=1.00）。這說明YE的加入不能增強WSA的鮮味強度。在吐后（45 s～100 s），樣品之間在殘留鮮味強度上沒有差異（p=0.57），即對于殘留鮮味強度，WSA與YE之間并沒有顯著的相互作用。

2.4 美拉德反應產物（MRPs）適宜濃度的選取結果

在0.3%MSG+0.1%NaCl的基質溶液中，加入不同量的MRPs以檢測其對鮮味強度的影響。不同濃度下MRPs對應的鮮味強度見圖7，結果顯示MRPs濃度對混合溶液鮮味強度有顯著影響（p=0.013）。

由圖7可知，鮮味強度隨著MRPs的濃度升高（0.1%～0.5%）而變強，且呈現良好線性關系（R2=0.967 3）。且0.1%MRPs的鮮味強度分值為50左右，表現出適宜的鮮味強度，據此，后續鮮味評定試驗采用0.1%MRPs濃度。

圖7 不同濃度下美拉德反應產物（MRPs）的鮮味強度Fig.7 Umami intensity perceived from different concentrations of MRPs

2.5 一元/二元鮮味物質與美拉德反應產物（MRPs）混合溶液鮮味強度測定結果

0.1%MRPs與一元或二元鮮味物質的混合溶液鮮味強度測定結果如圖8所示，其中對照組為0.1%MRPs+0.1%NaCl（即基質溶液）。

圖8 不同鮮味物質對美拉德反應產物（MPRs）鮮味的影響Fig.8 The influence of different umami substantces on enhancing MPRs umami taste perception

圖8表明，樣品之間的鮮味強度有顯著性差異（p＜0.000 1），添加了WSA與I+G的混合溶液呈現最強鮮味，且顯著的比0.3%MSG的混合溶液和基質溶液鮮味強（相對應的p＜0.000 1，p＜0.000 1）。Wang等[18]對河鲀魚肌肉酶解物美拉德反應的研究表明，3個不同級分肽段得到的MRPs相比于空白對照組在鮮味、濃厚味、可接受性方面均有提高。Yang等[16]測定了河鲀副產物酶解物的游離氨基酸含量，結果表明，相比于未經過酶解處理的對照組（267.49 mg/100 g），酶解物具有更高的游離氨基酸（1 733.19 mg/100 g）。據此可以推斷，MRPs對鮮味的提升，可能是由于該產物本身的滋味、特征香氣、理化特性的綜合影響；也有可能WSA與I+G混合溶液的加入對MRPs的鮮味有顯著性提升，并且該提升相比于其他混合溶液是最大的。然而，與MSG相比WSA與YE的混合并沒有帶來鮮味的顯著提升（p=1.00）。

2.6 美拉德反應產物（MRPs）混合液體的流變特性測定結果

研究表明濃稠度的增大會改變食品的質構從而影響滋味物質在口腔中的釋放，進而影響滋味呈味[30-31]。針對上述不同MRPs混合溶液所產生的不同鮮味強度，對樣品的黏度特性進行了測定。各混合溶液黏度測定結果見圖9。

由圖9可知，隨著剪切速率的增加，混合溶液展示出剪切稀化特性。數據分析表明，不同樣品的黏稠度在不同剪切速率下沒有差異（p=0.46）。其中0.1%MRPs的混合溶液和0.5%MRPs的混合溶液之間沒有差異，表明MRPs的加入量不會對黏稠度造成影響，因此不同濃度MRPs對鮮味強度的影響不是由流變特性導致，是由于MRPs本身香氣和鮮味物質導致的。

圖9 MRPs不同混合溶液黏度Fig.9 Viscosity of different mixed solutions of MRPs

3 結論

本試驗以琥珀酸二鈉（WSA）為研究對象，通過2-AFC法對WSA與I+G和YE二元相互作用進行鮮味強度定量探究，并通過TI法，對這些混合溶液的二元相互作用進行鮮味動態變化研究。結果表明WSA與I+G在0.35%∶0.4%濃度比例下，表現出最強鮮味。WSA與YE在0.35%∶0.5%比例下表現出較高的鮮味強度。在動態感官試驗中，I+G的加入可以顯著增強WSA的鮮味強度。該試驗將靜態感官與動態感官相結合，對鮮味物質二元相互作用下的即時鮮味和殘留鮮味進行分析，全面研究了WSA與YE及I+G的二元呈鮮作用。

此外，結合團隊前期研究的成果，制備河鲀副產物酶解物的美拉德反應產物（MRPs），發現MRPs本身可以提升鮮味，并且其他鮮味物質的加入會顯著提升MRPs的鮮味，MRPs∶WSA ∶I+G=0.1% ∶0.35% ∶0.4%可作為制備呈味基料的配方。該試驗針對以MRPs為主的呈味基料進行了初步研究和開發，可為制備鮮味呈味基料，開發新型增鮮劑提供理論依據。