北沙參不同部位提取物鎮咳祛痰作用研究＊

何軍偉，朱繼孝，楊 麗，張壽文，程 訪，曾金祥，鐘國躍＊＊

（1. 江西中醫藥大學 中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004；2. 江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜（Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq.）為多年生草本植物，生長于海邊沙灘或栽培于肥沃疏松的沙質土壤，主產于內蒙古赤峰、山東萊陽及河北安國。北沙參為該植物的干燥根，又稱萊陽參，夏、秋二季采挖，直接洗凈陰干或除去須根后沸水燙制，去皮或不去皮[1-3]。北沙參為傳統常用的大宗中藥材，其味甘、微苦，性微寒，養陰清肺、益胃生津，主要用于肺熱燥咳等[1]。該藥材也在蒙醫藥學中廣泛使用，藥用歷史悠久，其蒙文音譯漢文名為“查干-掃日勞”，具有清肺、止咳等功效，主要用于治療肺熱咳嗽等疾病[4]，可知鎮咳和祛痰是北沙參最主要的功效之一。臨床上，含有北沙參藥材的中成藥較多，如掃日勞清肺止咳膠囊、北沙參四味湯、七味沙參湯散、八味檀香散，其中掃日勞清肺止咳膠囊為重要的蒙藥復方，近年來每年的銷售額超過一億元。

據報道[5-19]，北沙參提取物或萃取部位具有多種生物活性，包括免疫調節、鎮咳、祛痰、細胞毒性、酶抑制活性等藥理作用。此外，屠鵬飛等[8]采用小鼠模型評價了多種中藥沙參（包括北沙參）類的鎮咳、祛痰作用，結果表明北沙參乙醇提取物具有較強的鎮咳作用，但其祛痰作用較弱。另外，北沙參提取物及其各萃取部位鎮咳、祛痰作用的譜-效關系尚無報道。因此，亟需對北沙參乙醇總提物及其各萃取部位進行深入的鎮咳、祛痰活性研究，尤其進行北沙參的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜與鎮咳、祛痰活性的關聯性研究。北沙參具有豐富的化學結構類型，包括：苯丙素類、單萜類、簡單酚酸類、聚炔類、揮發油類等，具有抗炎、細胞毒性、抗菌、抗氧化、鎮痛等藥理作用[15,20-29]。然而，北沙參鎮咳、祛痰的化學成分、生物活性及作用機制仍不清楚。本課題組前期從北沙參乙醇提取物中報道了16 個化學成分，包括3 個生物堿類（(3S)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(1)、(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-卡巴林-3-羧基(2)、(1R,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-卡巴林-3-羧基(3)）、4 個 苯 丙 素 類（(S)-phenyllactic acid (4)、(S)-phenyllactic acid methyl ester (5)、 scopoletin(6)、isopimpinellin(7)）、4 個 簡 單 酚 酸 類（catechol(8)、salicylic acid(9)、 4-hydroxyphenethyl alcohol (10)、vanillic acid 1-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]ester(11)）、1 個 鄰 苯 二 甲 酸 酯 類（dibutyl phthalate(12)）、3 個 聚 炔 類（falcarinol(13)、falcarindiol(14)、(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol(15)）和1 個脂肪酸類化合物（9-hydroxystearic acid (16)[30]。此外，還對上述分離得到的所有化合物進行詳細的化學分類、以及在進化過程中的親緣性進行了推測和系統的分析。

北沙參為常用中藥材，自1963 年版《中國藥典》始，歷版《中國藥典》均有收載。2015年版《中國藥典》僅對北沙參藥材的【來源】、【性狀】和【顯微鑒別】（橫切面組織特征）項進行了描述；《香港中藥材標準》（2010 年版，第三冊）規定有【來源】、【性狀】、【鑒別】（橫切面組織特征，粉末特征，法卡林醇對照的薄層鑒別，指紋圖譜）、【檢查】、【浸出物】、【含量測定】項。因此，北沙參藥材的質量標準極不完善，且其有效成分尚不清楚，亟需對該藥材鎮咳、祛痰的化學成分、藥理作用、及其關聯性進行系統地研究。

采用譜-效學關聯性研究對解決中藥及民族藥的物質基礎，建立藥材的質量標準體系具有十分重要的意義[31]。本研究采用灌胃小鼠北沙參總提取物（BSS總）、石油醚萃取部位（BSS-A）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B）、正丁醇萃取部位（BSS-C）和水部位（BSSD），考察北沙參總提取物及其不同極性溶劑萃取部位的鎮咳、祛痰作用，并初步探討了提取物HPLC 指紋圖譜與鎮咳、祛痰作用的關聯性，為闡明該藥材的藥效物質基礎提供科學依據，也為建立科學、簡便的質量控制體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級別的昆明小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體質量在18-22 g 之間，雌雄各半，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 試劑與材料

咳必清（批號：130304，上海全宇生物科技內鄉制藥有限公司）；氯化銨（批號130517）、濃氨水（批號131011）、碳酸氫鈉（批號120219）（西隴化工股份有限公司）。

本實驗中所用北沙參藥材來自內蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，經鑒定為傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜（G.littoralis）的干燥根。

1.1.3 主要儀器

旋轉蒸發儀（BUCHI，步琦公司，瑞士）、高效液相色譜儀（SHIMADZU，島津公司，日本）、超聲波清洗器（KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司，中國）、紫外可見分光光度計（UV-1800，島津公司，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 北沙參提取物制備

干燥的北沙參藥材（10.0 kg）、粉碎，依次用80%（100 L）、40%（100 L）的乙醇常溫滲濾提取，合并提取液，減壓蒸除乙醇，得深褐色總浸膏（BSS 總，2.14 kg）。然后，將BSS總溶于一定量的水中，分別用不同極性溶劑等體積萃取5次，減壓蒸除溶劑，依次得到石油醚萃取部位（BSS-A，58.0 g）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B，22.5 g）、正丁醇萃取部位（BSS-C，121.1 g）和水部位（BSS-D，1 799 g）。以上提取物用一定量的水溶解，配置成低劑量為1.0 g·kg-（1按生藥量計算）和高劑量為2.0 g·kg-1混懸液，備用。

1.2.2 鎮咳實驗

將120 只小鼠隨機的分為12 組，每組10 只：正常組，咳必清組，及10個藥物組，即BSS 總組、BBS-A 組、BSS-B 組、BSS-C 組、BSS-D 組的高、低劑量組。自由飲食飲水，連給藥3 d。采用濃氨水噴霧法[32]，嚴格按照文獻實驗步驟進行操作，并記錄每只小鼠在接受噴霧濃氨水后2 min內的咳嗽次數。

1.2.3 祛痰實驗

12 組小鼠均自由飲食飲水，連給藥3 d。采用小鼠氣管酚紅排泄實驗法[32]，嚴格按照該文獻的實驗步驟進行操作，最后根據標準曲線計算出每只小鼠酚紅排泄量。

1.2.4 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC指紋圖譜色譜條件

色譜柱：島津反相分析色譜柱（IntertSustain C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇（B），兩相溶劑中均加入0.1%甲酸，梯度洗脫（0-8 min，5%-5%B；8-10 min，5%-15% B；10-12 min，15%-20% B；12-35 min，20%-30%B；35-45 min，30%-50%B；45-53 min，50%-75%B；53-63 min，75%-95%B；63-65 min，95%-100% B；65-80 min，100%-100% B）；進樣量：30 μL；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃。

1.2.5 供試品溶液的配置

依次配置 100.0、20.0、20.0、20.0、20.0 mg·mL-1的BSS 總、BSS-A、BSS-B、BSS-C 和 BSS-D 溶液，高速離心，取上清液至棕色安培瓶中，備用。

1.2.6 統計學分析

統計學處理采用SPSS 19.0 軟件，數據結果用均數±標準差（-x±s）表示，組間比較t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 北沙參總提取物及各萃取部位對模型小鼠的鎮咳作用

由表1可知，與正常組比較，北沙參總提取物在低和高劑量、BBS-A 在低和高劑量、及BBS-B 在高劑量下均能顯著地減少模型小鼠在2 min 內的咳嗽次數（P<0.01），即顯示出較強的鎮咳作用，并強于陽性對照藥咳必清。此外，與正常組比較，BBS-B 在低劑量、BBS-C 在高劑量、及BBS-D 在低和高劑量下均能有效的減少模型小鼠在2 min 內的咳嗽次數，但不顯示出顯著性的差異性（P>0.05）。

表1 北沙參總提取物及其各萃取部位對小鼠的鎮咳作用（-x ± s，n=10）

2.2 北沙參總提取物及不同萃取部位對模型小鼠的祛痰作用

由表2 可知，與正常組比較，BBS 總及其四個萃取部位（除BBS-A 低劑量）在低和高劑量下均能有效地增加模型小鼠的酚紅排泄量。其中，BBS總在低劑量、BBS-A 在高劑量、BBS-B 在低和高劑量、BBS-C 在低劑量、及BBS-D 在低和高劑量下均能顯著地增加模型小鼠的酚紅排泄量（P<0.01 或P<0.05），即顯示出較強的祛痰作用。此外，BBS-C 在低劑量下表現出最強的祛痰作用，為主要的有效部位。

2.3 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC指紋圖譜

由圖1可知，北沙參總提取物具有豐富的色譜峰，并具有較好的分離度。此外，各萃取部位之間有一定的交叉情況，可能是導致上述的鎮咳、祛痰藥理作用分散的重要原因。根據表1 和表2 的藥理結果表明，北沙參鎮咳作用的有效部位主要是極性中等偏小的部位，即石油醚和乙酸乙酯萃取部位。同時，北沙參祛痰作用的有效部位主要是中等偏大的部位，即乙酸乙酯、正丁醇部位和水部位。

3 討論

北沙參為傳統大宗中藥材，藥用歷史悠久，體內鎮咳、祛痰作用顯著，可單用或配伍使用，但其相關的藥效物質基礎和譜-效關系仍不清楚。本研究采用經典的鎮咳、祛痰小鼠模型，考察了北沙參乙醇總提取物及其四個不同極性溶劑萃取部位對模型小鼠的作用，結果表明，北沙參鎮咳、祛痰的物質基礎是有差異的，也存在一定的關聯，即鎮咳作用的有效部位主要是石油醚和乙酸乙酯萃取部位，而祛痰作用的有效部位主要是乙酸乙酯、正丁醇和水部位。屠鵬飛等[8]對市場上10種沙參類中藥材進行了鎮咳、祛痰作用的比較研究，表明北沙總提取物具有顯著地鎮咳作用，但其祛痰作用不明顯。根據本實驗的研究結果表明，北沙參總提取物是具有較強的祛痰作用，與文獻[8]得出不一致的結論，可能是由于藥材產地（山東萊陽）、采收季節、加工方式、提取溶劑（乙醇溶液）等因素所致提取獲得的北沙參提取物的有效成分的數量和種類方面的差異。此外，本研究采用HPLC 技術分析了BSS 總及其四個萃取部位BSS A-D 的色譜峰，并與小鼠鎮咳、祛痰試驗進行了色譜峰-生物活性關聯性分析，表明北沙參鎮咳作用主要是極性中等及中等偏小的化學成分，而祛痰作用主要是中等及中等偏大的化學成分，造成生物活性及其分散可能與萃取的手段等過程有關。結合本課題組前期對北沙參乙醇提取物的化學成分研究表明，北沙參發揮鎮咳作用的主要成分可能為聚炔類、鄰苯二甲酸酯類和脂肪酸類化合物，而北沙參發揮祛痰作用的主要成分可能為β-卡巴林生物堿類、苯丙素類和簡單酚酸類化合物[30]。

表2 北沙參總提取物及其各萃取部位對小鼠的祛痰作用（-x ± s，n=10）

圖1 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC圖譜

北沙參為傳統大宗中藥材，自1963 年以來歷版《中華人民共和國藥典》均有收載，但該藥材的質量標準仍不完善?！断愀壑兴幉臉藴省罚?010 年版，第三冊）規定有【來源】、【性狀】、【鑒別】（橫切面組織特征，粉末特征，法卡林醇（falcarinol）對照的薄層鑒別，指紋圖譜）、【檢查】、【浸出物】、【含量測定】項，【含量測定】項中以法卡林醇（又稱人參炔醇）為指標成分，采用HPLC 測定含量，規定其限量為不得低于0.023%。據文獻[33-35]報道，聚炔類可能是北沙參的主要活性成分之一，為該植物中含量最高的一類成分。此外，香豆素類成分報道也很多，但該類成分的含量較低。本實驗結果表明，北沙參鎮咳部位的主要成分為聚炔類成分 falcarinol、falcarindiol 和(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol，進一步提示香港中藥材標準2010年版中采用法卡林醇作為北沙參藥材的質量控制指標具有一定的合理性。然而，對于北沙參祛痰作用的有效成分中的質量控制指標尚不清楚。此外，來源于北沙參藥材中的多糖具有較強的免疫調節作用[9-11,36-38]。因此，需對北沙參藥材中多糖類成分進行深入的研究，并確定其質量標準質控指標。據此，本研究結果為闡明北沙參鎮咳、祛痰的物質基礎奠定了基礎，為該藥材的質量評價的建立提供了一定的參考。