基于網絡藥理學的蛹蟲草活性成分抗炎癥作用的藥效機制

竇瑤 魏琳 宋伍 孫聰 王宏英 王衛芳 郭艷霞 閻慧 郭寰宇 梁雪嬌 毛璐 周曉晶

(長春中醫藥大學 1臨床醫學院，吉林 長春 130117；2藥學院)

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草。屬子囊菌門、肉座菌目、蟲草菌科、蟲草屬(Cordyceps)〔1〕，與冬蟲夏草為同屬異種。蛹蟲草與冬蟲夏草具有幾乎相同的藥用成分〔2〕，其中活性成分如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、維生素、微量元素和超氧化物歧化酶等的含量比冬蟲夏草還要高，且蛹蟲草生長較快易于人工培養，作為蟲草屬的模式種，目前已廣泛被國內外科研人員所認知和接受并成為科學研究的熱點，蛹蟲草已逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品。在《全國中草藥匯編》中已有記載：“蛹蟲草(北蟲草)的子實體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥?！蔽覈摹吨腥A人民共和國藥典》把蛹蟲草的藥理功效歸納為補肺益腎、止咳化痰。用于慢性支氣管炎癥屬肺腎氣虛、腎陽不足者；癥見咳嗽氣喘、咯痰、自汗、惡風、易感、身寒肢冷、腰酸肢軟、乏力、頭昏耳鳴等。無論是古代藥書中對蟲草“止血化痰，治諸虛百損”的記載還是現代《藥典》中對蛹蟲草藥效的歸納，在蛹蟲草的多種藥理作用中，抗炎癥作用已成為目前國內外的科研熱點。

炎癥是威脅人類健康的一種常見病和多發病。從一方面來說，炎癥是有利于機體的防御反應。但炎癥反應對人體也存在重大威脅，過度的炎癥反應可能致傷致殘甚至危及生命。目前，每年全球約有8 500萬慢性炎癥患者和 193 萬急性炎癥患者都承受著病痛的困擾〔3〕。最新研究表明，炎癥已經與腫瘤的發生聯系起來〔4〕。因此，炎癥是醫學研究中最原始、最復雜又最具挑戰的新課題。

蛹蟲草的活性成分蟲草素即3′-脫氧腺苷，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。蟲草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用〔5〕。以蟲草素為主要成分的新藥已臨床上試用于白血病的治療，有良好的臨床應用前景〔6〕。蟲草酸，即D-甘露醇，是蟲草的主要有效成分之一。蛹蟲草中的蟲草酸含量要高于天然的冬蟲夏草〔7〕。蟲草酸具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮喘祛痰等藥理作用。在臨床上可用于血管痙攣、腦血栓、抗氧化、利尿脫水、鎮咳、祛痰平喘、腎衰竭的治療〔8〕。然而蛹蟲草的這兩種活性成分在炎癥作用發揮的藥效機制尚不清楚。

網絡藥理學可通過對多種復雜網絡及多水平相互連接的分析闡述中藥多成分、多靶點的潛在作用及作用機制，可通過系統觀察藥物對生物網絡的干預與影響，揭示中藥整體調控的藥效機制〔9〕。

本研究基于網絡藥理學的原理，構建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用蛋白質互作網絡。并依據該網絡，以脂多糖誘導的RAW264.7細胞為模型，在確立蟲草素和蟲草酸合適的干預濃度和時間后，對在互作網絡中篩選到的關鍵節點蛋白質的基因表達情況進行分析。以期從多成分、多靶點整合作用的角度，揭示蛹蟲草的抗炎癥作用機制。

1 材料與方法

1.1化學結構研究 通過PubChem數據庫分別檢索蛹蟲草的活性成分蟲草素和蟲草酸的2D、3D結構，隨后下載并保存2D和3D結構的SDF格式文件。

1.2蟲草素和蟲草酸作用靶點和炎癥作用靶點研究 將獲得的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的化學結構(2D結構和3D結構)的SDF格式文件導入pharmmapper數據庫，預測蟲草素和蟲草酸的作用靶點。隨后通過Uiprot、Pubme等數據庫對獲取的化合物作用靶點名稱進行矯正。

Genecards是一個以基因為中心的數據庫，每個人類基因都有一個網頁。 以炎癥“inflammation”為關鍵詞進行檢索并下載有關的全部基因。使用“Venny”將化合物作用靶點與炎癥作用靶點取交集得到化合物抗炎靶點，用于后續研究。

1.3活性化合物-靶點網絡和靶點-疾病網絡的構建 通過Cytoscape3.2.1軟件將蟲草素和蟲草酸靶點和抗炎癥作用靶點，構建蟲草素和蟲草酸抗炎癥靶點網絡圖，初步探究蟲草素和蟲草酸對抗炎的藥理作用和機制。

1.4蛋白互作(PPI)網絡的構建 為了研究靶點蛋白在系統水平上的相互作用，確定化合物作用靶點群，將化合物治病靶點基因上傳至在線STRING10.5軟件，構建由導入基因表達產物組成的PPI網絡，并且利用Origin9.1軟件對PPI網絡中的蛋白繪制條形圖。

1.5基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 本研究采用David v 6.8 數據庫對1.4的靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從通路分析來闡釋藥對生物學角度的科學內涵。

1.6互作網絡中篩選到的8個關鍵節點蛋白質的基因表達情況分析 首先以1 μg/ml脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞24 h構建炎癥反應模型，然后設置濃度梯度確立蟲草素和蟲草酸對細胞合適的干預濃度，設定的蟲草素和蟲草酸干預濃度為12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L，并設置干預時間分別為24 h、48 h。同時以賴氨匹林(100 mg/kg)干預LPS誘導后RAW264.7細胞24 h和48 h作為陽性對照。提取上述處理細胞的總RNA，并在此基礎上利用qRT-PCR方法對在互作網絡中篩選到的8個信號轉導通路中的關鍵節點蛋白質的基因表達情況進行分析。

2 結 果

2.1收集蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的相關靶點 通過將蟲草素和蟲草酸的2D和3D化學結構導入pharmmapper數據庫和ChEMBL數據庫預測蟲草素和蟲草酸作用靶點。收集到蟲草素的靶點蛋白質共有91個：PRIM1、GPI、CRKL、MAGI1、MSH2、NUB1、ERBB2、TTR、SLC30A9、RNF8、PCNA、CPA1、CSNK1G1、RBKS、HHEX、ALDH3A1、RRM1、RAN、NLGN1、SMURF2、MDH2、EXTL2、NR1I3、VEGFA、MTA3、NUDT4、SSB、CPB2、PATJ、CD3E、GSS、PUS10、PLK4、SULTA4A1、SRP19、MICA、STAT5A、P4HB、SMG7、ACTR3、DPP4、CA14、PROC、FLNB、OLA1、SEPSECS、SACS、EWSR1、PTPRD、LPA、BPHL、ZCWPW1、RAB26、PA2G4、F2、POU1F1、ARF6、SKP1、UBTF、SWAP70、NCR1、ACAD11、TOM1、EIF5A、ACTA1、SEC13、B2M、ARSA、RAP1GAP、CDKN1B、SORCS2、POU2F1、DNAJC16、APR6、ALB、RNASE1、BBX、THOC1、UBE3A、PCYT2、GSTM1、GARS、DHPS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF；蟲草酸靶點蛋白質共82個：ACTR3、PRIM1、TNFRSF1A、ZKSCAN5、QPRT、CPB2、CRDL、HTATIP2、PATJ、MAGI2、NCAM1、SEC13、RINS2、NUB1、TTR、CYP2C8、PPAT、GSTM4、RRM1、SRR、CNTN2、GDI1、SLC30A9、NCR1、MSH2、LOX、PRDM4、MUS81、SH3BGRL、FLNB、CYB5A、PAX5、IGFBP1、EIF5A、RPL9、CDKN1B、COTL1、SDK2、SAP18、DAPK2、ACTA1、CPM、ATP6V1A、TRAF4、OGG1、GALK1、GPI、NR1I3、ARHGAP21、PLK4、EXTL2、MDH2、MDH1、POU2F1、CNN2、WNK1、CNKSR1、ELOF1、EPS8L2、TXNL4B、VRK2、COL20A1、PPP1CB、HNF1B、DLD、CD3E、SKPQ、ESRRB、DAAM1、GAD2、GDA、TP63、TOM1、RBKS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF。

2.2挖掘到抗炎癥作用相關靶點的蛋白質 以“inflammation”為關鍵詞在 Genecards數據庫進行檢索并下載有關的全部基因，共獲得9 000多相關基因。使用“Venny”將化合物作用靶點與炎癥作用靶點取交集得到蟲草素和蟲草酸的抗炎靶點86個，用于后續研究。

2.3構建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點的PPI網絡 依據String數據庫中檢索到的蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點的PPI數據信息，導入PPI網絡可視化軟件Cytoscape3.6.0，對每個靶點的PPI數據進行計算，去掉數據重復信息，構建復雜的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的“藥物活性成分-靶點-疾病蛋白網絡”即與抗炎癥作用-網絡。見圖1。

2.4蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點的通路富集分析 對蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發現，這些靶點分布在35條通路當中，根據P>0.01篩選出26條(見表1)，其中KEGG通路通過查看基因在通路中的分布情況，可以了解該基因在代謝、信號轉導等通路中的作用。

圖1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點的PPI網絡

表1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點的通路富集分析

2.5選取蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點的PPI網絡中關鍵節點 依據蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用的PPI網絡及網絡中的GO和KEGG分析數據，結合抗炎癥作用關鍵的細胞信號轉導通路，選擇蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸在炎癥作用中的關鍵作用蛋白質8個：TLR4、ERK1、COX-2、P38、iNOS、IL-6、NF-κB、TNF-α。

2.6通過細胞水平的實驗探究蛹蟲草介導多條信號轉導通路的抗炎癥作用藥效機制 蟲草素和蟲草酸干預24 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，8個關鍵靶點蛋白均明顯下調。其中，COX-2、ERK1、iNOS、TNF-α 4個靶點蛋白蟲草酸干預24 h后比蟲草素干預24 h后下調更明顯；IL-6、TLR4 2個靶點蛋白蟲草酸干預24 h后與蟲草素干預24 h后無明顯區別；P38蟲草素干預24 h后比蟲草酸干預24 h后下調更為明顯；NF-κB雖然在蟲草素和蟲草酸干預24 h后也表達下調，但NF-κB表現為對蟲草素和蟲草酸濃度更加敏感，低濃度蟲草素/蟲草酸和中濃度的蟲草酸干預24 h后NF-κB表達下調更加明顯，中、高濃度蟲草素和高濃度蟲草酸干預24 h后反而表達上調。蟲草素和蟲草酸干預48 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，明顯表達下調的靶點蛋白包括：ERK1、iNOS、P38、TLR4、TNF-α、NF-κB；明顯表達上調的靶點蛋白包括：COX2、IL6。蟲草素和蟲草酸干預24 h后的靶點蛋白表達情況更有分析意義。見圖2。

3 討 論

盡管抗炎癥作用的機制還有待探討，本研究采用網絡藥理學篩選出蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用的86個靶點蛋白。通過活性成分-靶點-疾病網絡特征分析，構建了靶點蛋白的互作網絡，并將靶點蛋白富集在26條信號通路中，如NF-κB信號轉導通路，NF-κB是前炎癥因子基因表達調節的關鍵成分之一，誘導前炎癥細胞因子、趨化因子、黏附分子等表達〔10〕。NF-κB在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，如類風濕關節炎、炎癥性腹瀉、多發性硬化癥、哮喘等〔11〕。受體蛋白TLR是動物體與生俱來的一類免疫蛋白，在非特異性免疫過程中起到至關重要的作用〔12〕，其受體蛋白為TLRs。TLRs完成了非特異性免疫的最初識別步驟的同時也可介導LPS誘發的多種細胞反應的中間受體，其活性與表達程度直接決定了巨噬細胞的激活程度〔13，14〕。TLR信號轉導通路富集到的4個靶點蛋白在腸炎信號通路、肺結核信號通路、類風濕關節炎信號通路，這3條炎癥相關信號通路中同樣被富集，說明這些靶點蛋白為多種炎癥疾病的共同調控因子。TNF信號轉導通路中富集了3個關鍵靶點蛋白(IL6、TNF-α、NFKB)，其中TNF-α是一種參與免疫應答的細胞因子，還是一種重要的炎癥介質，TNF-α還對腫瘤細胞有細胞毒性、細胞溶解、抑制增殖等作用〔15〕。說明炎癥與腫瘤之間存在密切聯系。

綜上，蛹蟲草的有效成分通過上述靶點相互作用，實現其抗炎等作用。本研究結果為進一步闡釋蛹蟲草抗炎癥作用的藥效機制奠定了理論基礎，也為后續的實驗研究提供了科學依據。