一株羊種變異布魯氏菌分離株遺傳特征分析

楊曉雯，韓秀瑞，樸東日，趙鴻雁，田國忠，姜 海

布魯氏菌(Brucella)是一種兼性胞內寄生菌，易造成宿主持續性感染，引起全球性人獸共患流行性疾病—布魯氏菌病。該病主要表現為發熱、多汗、乏力、關節疼痛等癥狀，嚴重者使患者喪失勞動能力，影響公共衛生安全以及經濟發展[1]。人感染布魯氏菌若診療不及時，容易引起各種并發癥，如脊柱炎、心內膜炎、腦炎等[2]。羊種、牛種、豬種和犬種布魯氏菌能夠感染人。全球人間布魯氏菌病發病率年平均超過50萬例[3]，中東地區每百萬人口的布魯氏菌病發病率均在200以上，敘利亞發病率最高(1 603.4/10萬)，但據世界衛生組織(WHO)調查表明，實際發病率是報告的10～25倍[4]。我國布魯氏菌病首次報道于內蒙古[5]，人間布魯氏菌病疫情于1957-1963年和1969-1971年出現兩次流行高峰。隨著動物布魯氏菌病疫苗的使用，上世紀80-90年代人畜布魯氏菌病發病率顯著下降[6]，但自20世紀90年代中期開始，布魯氏菌病疫情在國內再次肆虐，并從北方擴展到南方[7]，全國32省市自治區均有病例報道[8]。

自然條件下，除犬種和綿羊附睪種布魯氏菌外，其余種型布魯氏菌為光滑型布魯氏菌。布魯氏菌的表型主要由外膜外側的脂多糖(LPS)決定。LPS由類脂A、核心寡聚糖和O抗原組成，根據LPS是否含有O抗原，將布魯氏菌分為光滑型和粗糙型，光滑型布魯氏菌的LPS含有O抗原(S-LPS)，而粗糙型布魯氏菌的LPS缺少O抗原(R-LPS)[9]。粗糙的布魯氏菌的致病力降低，而粗糙型通常不會引起人類布魯氏菌病[10]。本研究針對課題組保存的菌株，經表型鑒定后，利用全基因組測序技術對變異羊種布魯氏菌進行測序，分析其遺傳特征，為我國布魯氏菌病的防控提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1布魯氏菌菌株 布魯氏菌標準菌株和變異菌株于中國疾病預防控制中心傳染病所BSL-3實驗室內傳代培養及增殖。布魯氏菌標準菌株基因組序列及其氨基酸序列于NCBI Refseq數據庫中下載(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/brucella/)。

1.2粗糙表型鑒定 利用單因子R血清、三勝黃素檢測表型。取培養后的布魯氏菌，利用生理鹽水調整其比濁度為0.5 McF，取30 μL菌液與分別等體積的單因子R血清和三勝黃素混合，2 min觀察實驗結果。粗糙型布魯氏菌存在凝集現象，而光滑型布魯氏菌不凝集[11]。

結晶紫染色檢測表型。待平板上長出單菌落后，稀釋結晶紫染液至工作濃度，覆蓋單菌落表面染色15～20 s，棄掉染液后放大鏡觀察菌落著色情況。粗糙型布魯氏菌著色，被染成紅色或者紫色；光滑型菌落不著色，仍然為原來的黃色或黃綠色[11]。

1.3LPS提取及鑒定 劃線培養布魯氏菌，取適量培養48 h的菌體，利用生理鹽水調整比濁度為1.5 McF，此時細菌濃度約為1.0×109CFU/mL。將菌液于室溫下13 000 r/min離心，棄掉上清液，重復2～3次，獲取足夠的細菌，然后按照脂多糖提取試劑盒(iTron，韓國)的操作說明提取LPS，-20 ℃保存。將提取的LPS利用SDS-PAGE(康為世紀，中國)檢測，選用銀染試劑盒(碧云天，中國)染色。

1.4全基因組測序 劃線培養菌株，取適量培養48 h的菌體，使用Wizard Genomic DNA Purification試劑盒(Promega，美國)提取細菌基因組DNA。檢測合格的基因組DNA，使用Nextera XT Library Prep試劑盒(Illumina，美國)添加接頭，進行了測序文庫的制備。將序列送交華大基因有限公司(中國)，使用Illumina / Solexa測序分析儀對文庫進行測序，基因組覆蓋度大于100倍(100 ×)。

測序完成后獲得原始數據(raw data)，應用fastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)進行測序質量評價，去除冗余序列及質量低的序列。同時，將通過測序質量評價的序列去掉接頭，即為clean data，后續分析使用clean data進行。

1.5比較基因組分析 利用BWA[12]將clean data比對到參考基因組上，允許最大gap為5，應用samtools[13]輸出測序深度，同時輸出4 ×和20 ×測序覆蓋度，利用excel統計測序深度和覆蓋度。利用velvet[14]將clean data進行組裝成大片段序列contig，利用BLAST將contig在全基因組中定位，利用Vector NTI設計引物將gap補全成為完整基因組，利用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP)[15]進行全基因組注釋。

利用samtools和GATK[16]相結合的方法檢測SNP和InDel，更準確地對變異進行識別。通過多種算法各自識別的SNP和InDel進行一致性分析，保留具有高度一致性的變異作為最終結果，這些高度一致性的SNP和InDel具有非常高的可信度。將最終結果利用GATK進行過濾，留下測序質量大于20且兩個SNP的距離不小于5的SNP和InDel。

將參考基因組的序列建庫，提取出參考基因組的蛋白編碼序列，蛋白序列和信使RNA序列(mRNA)等，利用snpEff[17]對找到的變異進行注釋，包括同義突變，錯義突變，移碼突變等，同時利用excel統計每個樣品的變異位點，數量和每kb SNP的大小用于比較變異率。

對完整的基因組來說，利用MAUVE[18]將全基因組比對SNP結果輸出；對測序樣品來說，利用samtools和GATK結合尋找變異位點，從過濾后的最終結果中提取出SNP位點。利用phyloSNP將兩者的輸出結果構建矩陣，采用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構建進化樹，自檢值為1 000。

2 結 果

2.1變異羊種布魯氏菌 本研究發現，分離自寧夏的1株羊種布魯氏菌能夠與R血清和三勝黃素(圖1)發生凝集，且被結晶紫染色，初步判斷該菌株為變異羊種布魯氏菌。

圖1 三勝黃素凝集試驗檢測布魯氏菌表型Fig.1 Rough phenotype detection by acriflavinium chloride

提取該菌株以及參考布魯氏菌菌株的LPS后，利用SDS-PAGE凝膠檢測，發現羊種布魯氏菌參考菌株16M、羊種疫苗株M5以及另外兩株分離株LPS條帶分布基本一致，除共有的條帶簇之外，在34-43 kDa，55-95 kDa及180 kDa附近也有明顯的LPS組成條帶分布(圖2)。而犬種布魯氏菌RM6/66和寧夏分離株的LPS則不具有以上3個條帶簇。從LPS的凝膠檢測條帶中可以發現，光滑型布魯氏菌含有長鏈的O側鏈，而寧夏分離株的脂多糖條帶更接近于粗糙型犬種布魯氏菌RM6/66，主要包括中鏈和短鏈的O側鏈，這和凝集試驗結果相一致。

2.2變異菌株全基因組注釋 寧夏分離株共獲得1.48 Gb大小的原始數據，過濾后共獲得1.25 Gb大小的clean data。利用velevet進行組裝時，收集大于500 bp的contig。寧夏分離株基因組草圖包含27個contigs，最長contig片段為609 252 bp，N50大小為358 887 bp，序列GC含量為57.24%。

1為蛋白marker，2為羊種布魯氏菌16M菌株的LPS，3為羊種布魯氏菌疫苗株M5菌株的LPS，4-5為其他分離株的LPS，6為犬種布魯氏菌RM6/66菌株的LPS，7為本研究涉及的寧夏分離株的LPS。圖2 SDS-PAGE檢測LPS的完整性Fig.2 Composition of LPS by SDS-PAGE

利用Vector NTI設計引物將gap補全成為完整基因組，結果發現，寧夏分離株的全基因組序列中包含兩條染色體，染色體1大小為2 126 100 bp，染色體2大小為1 185 600 bp，基因組大小為3 311 700 bp，GC含量為57.2%。該分離株基因組經注釋后含有3 379個CDS，9個rRNA，55個tRNA和4個ncRNA(圖3)。

圖3 羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株全基因組基因功能注釋圖Fig.3 Annotation of the whole genome sequences of the rough B. melitensis strain

2.3變異菌株遺傳特性分析 利用全基因組構建進化樹可知，寧夏分離株屬于羊種布魯氏菌，且與羊種2型標準菌株ATCC23457親緣關系最近。以羊種2型菌株ATCC23457為參考基因組，利用GATK和samtools尋找SNPs和InDel，結果發現，與參考菌株相比，該菌株存在282個變異，其中243個SNPs，39個InDel(17個Ins和22個Del)。SNP主要存在于C和T的變異之間，其中SNPs轉換(transitions，Ts)348個，顛換(transversions，Tv)137個，Ts/Tv率為2.54，變異率較低，表明基因組與參考基因組相比差異較小(圖4)。

圖4 羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株SNP及InDel在基因組中的分布圖Fig.4 Distribution of the SNP and InDel of the rough B. melitensis strain

已知的LPS合成相關基因中，假定甘露糖轉移酶(wboA，wboB)，甘露糖合成酶(manBo-Ag，manCo-Ag)，ABC轉運系統蛋白(wzt)，十一異戊烯-糖基轉移酶(wbkF)，異構酶/脫水酶(wbkD)和葡萄糖磷酸變位酶(pgm)基因均在寧夏分離株中均出現錯義突變，導致編碼氨基酸出現變異。LPS合成受阻后，最終導致寧夏分離株表型由光滑型變為粗糙型，見表1。

表1 已知LPS合成基因的變異統計表Tab.1 Missense variations of the LPS-related genes

3 討 論

LPS是布魯氏菌的重要毒力因子，對S-LPS合成過程中所需的基因進行突變、表達量改變以及調控基因突變可以導致產生結構不完整的R-LPS，使其毒力降低，可以作為弱毒活疫苗候選株。參與O抗原合成的基因主要有GDP-甘露糖脫水酶(gmd)、過骨胺合成酶(per)、甲?；D移酶(wbkC)、甘露糖糖轉移酶(wbkA、wbkE)、wbkD、wbkF和ABC轉運系統蛋白(wzm)、wzt等，另有兩個假定甘露糖轉移酶(wboA和wboB)[19]；與合成核心寡聚糖相關的基因主要有甘露糖酶(manBcore和manCcore)、甘露糖合成酶(manAo-Ag)、manBo-Ag和manCo-Ag、糖基轉移酶(wadA、wadB、wadC)、pgm[20]。參與類脂A合成的基因主要有?；?(?；d體蛋白)UDP-N-乙酰葡糖胺-O?；D移酶(lpxA)、UDP-3-O-?；?N-乙酰葡糖胺二乙酰酶(LpxC)、UDP-3-O-(3羥基肉豆蔻?；?葡糖胺N-乙酰轉移酶(LpxD)、脂質-A-二糖合成酶(LpxB)、Tetraacyldisaccharide-1-P4′激酶(LpxK)、2-脫氫-3-脫氧磷酸酯酸醛縮酶(KdsA)、3-脫氧-甘露糖基磺酸酯胞苷酰轉移酶(KdsB)、3-脫氧-D-甘露八油酸轉移酶(KdtA)、月桂酰?；D移酶(HtrB)[21]。自然條件下存在的布魯氏菌的表型變異主要存在兩個途徑：插入段片(如IS711)插入LPS合成相關基因中(如疫苗株RB51)和LPS合成相關基因缺失(如綿羊附睪種布魯氏菌缺失GI-2)[9]，這兩種表型變異機制均屬于LPS合成相關基因的突變/缺失。最新的研究表明，參與LPS和成相關基因的表達量變化也能導致菌株表型的突變。羊種布魯氏菌RM57為粗糙型菌株，與親本菌株羊種布魯氏菌M1981相比，參與LPS合成的基因未出現突變，但pgm基因表達水平改變，表明參與LPS合成的相關基因表達水平的變化也可能引起布魯氏菌表型的變化[22]。

由于缺少O抗原的保護，R-LPS更容易暴露靶標，影響布魯氏菌在細胞內的生存能力[23]，在感染細胞或機體內增殖能力和持續生存時間是布魯氏菌毒力判定的依據。這些因素導致了粗糙的布魯氏菌的致病力降低，而粗糙型通常不會引起人類布魯氏菌病[24]。研究表明，在沒有抗體等因素參與的條件下，粗糙型布魯氏菌侵入巨噬細胞的量要比光滑型布魯氏菌大，但侵入細胞形成早期布氏小體(Brucella-containing vacuole，BCV)后，光滑型布魯氏菌能夠抑制BCV與溶酶體融合，最終進入內質網，在細胞內存活；而粗糙型布魯氏菌無法逃避與溶酶體的融合，容易被細胞清除掉。粗糙型和光滑型布魯氏菌刺激機體產生的抗體不同，粗糙型布魯氏菌的抗體不影響血清學診斷，因此，粗糙型布魯氏菌用于疫苗候選菌株具有較大的應用前景。目前，布魯氏菌病得到有效控制的國家采取以下程序：選擇可靠的疫苗、制定恰當的免疫方案、形成廣泛的保護率、選擇合適的診斷方法，持續撲殺感染動物并嚴格控制感染動物群向無疫病動物群運輸動物?；谶@些措施，部分國家也成功消滅了人布魯氏菌病[25]。由于粗糙型布魯氏菌毒力較光滑型低，且其刺激機體產生的抗體不影響布魯氏菌的血清學診斷，因此，粗糙型菌株在疫苗研發中存在優勢。我國布魯氏菌病防控現狀嚴峻，布病發病數逐年增高，且遍布全國。疫苗作為布病防控中的手段之一，需要著重篩選疫苗候選菌株，結合我國布病流行的優勢菌株，才能更好更全面的用于我國布病的防控。

綜上所述，與單因子R血清、三勝黃素發生凝集且能夠被結晶紫染色的粗糙型變異羊種布魯氏菌分離株，全基因組測序表明，該分離株與羊種2型菌株相似性最高。其基因組由2條染色體組成，大小為3 311 700 bp，GC含量為57.2%，含有3 379個CDS，9個rRNA，55個tRNA和4個ncRNA。與參考基因組相比，該分離株存在282個變異，其中243個SNPs，39個InDel，變異率較低。已知的LPS合成基因中，8個存在錯義突變，LPS合成受阻，導致分離株表型由光滑型變為粗糙型。本研究為羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株的研究提供了基礎數據，同時也為布魯氏菌疫苗候選株的篩選提供新思路。

利益沖突：無