基于焦磷酸測序分析技術的金銀花摻偽鑒別方法研究

徐石勇,趙新,張富麗,劉征輝,史清洪,宋君,王永,蘭青闊*

1.天津市農業科學院, 天津 300381； 2.四川省農業科學院分析測試中心, 成都 610066； 3.天津大學, 天津 300072

金銀花為忍冬科(caprifoliaceae)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初開的花，又名忍冬，是常用大宗中藥材[1]，藥用價值較高，具有清熱解毒、宣散風熱等功效[2-3]，常用于各種熱性病，如身熱、發疹、發斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛[4]等癥。近年來,由禽流感、甲型流感、非典、手足口病、新型冠狀病毒[5-6]等病毒性疾病引起的全球季節性傳染病爆發頻繁。雖然金銀花的開發利用獲得了突破性進展，但優良品種相對較少，各地栽培品種各不相同，品種比較混雜，同物異名、同名異物的現象在不同地區時有發生[7-8]。于是一些不法商人便將價格便宜近10倍的紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand-Mazz.)、華南忍冬(LoniceraconfuseDC.)、黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)等山銀花(LoniceraeFlos)當做正品的金銀花銷售并使用[9-10]。為了確保臨床療效安全和消費者的權益，目前亟需建立科學性強、精準度高、實用方便的金銀花摻偽鑒別方法。

焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是應用于DNA序列分析的新一代檢測技術，是目前少數能進行實時、定量分析InDel/SNP標記等短片段變異的新型技術[11-12]。該技術先對目標區域進行PCR擴增，再對PCR產物進行測序[13]。在測序體系中，通過檢測光的釋放和強度，達到實時測定InDel/SNP不同基因型含量的目的。

本文基于SNP標記技術，結合焦磷酸測序分型分析技術，期望建立精準度高、通量大、便于應用的金銀花摻偽量的檢測方法，能夠在短時間內完成金銀花真偽及摻偽量的鑒定工作，為現代中藥摻偽鑒定開辟新的檢測技術。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

金銀花及其常見的偽品華南忍冬、黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬、紅腺忍冬等山銀花標準品，均由天津海世達檢測技術有限公司提供，研磨后提取DNA。

從河南、河北、山東等金銀花主栽地區獲得50份樣品見表1，市場銷售的含有金銀花(或山銀花)成分的15份中成藥見表2。

表1 金銀花主栽地區的50份樣品情況Table 1 The 50 dominant variety of honeysuckle in the main planting area

續表序號品種來源加工方法外觀A43金銀花巨鹿縣市場——A41金銀花巨鹿縣市場——A44金銀花巨鹿縣市場——A45金銀花巨鹿縣市場——A46金銀花平邑縣市場——A47金銀花平邑縣市場——A48金銀花封丘縣市場——A49金銀花封丘縣市場——A50金銀花封丘縣市場——

表2 15份市售含有金銀花(或山銀花)成分的中成藥Table 2 15 commercial TCM containing honeysuckle or Lonicerae Flos natural ingredients

1.2 試劑與儀器

CTAB、Tris-HCl購自Sigma公司；Na2EDTA購自SbaseBio公司；DL 2000 DNA Marker、20 bp DNA Marker購自TaKaRa公司；GoTaq? Master Mix溶液購自Promega公司；樹脂型基因組DNA提純試劑盒購自賽百盛公司；Sepharose Bead購自Biotage公司；氯化鈉、無水乙醇、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、冰乙酸均為國產分析純；引物由上海生工生物公司合成。

焦磷酸測序儀(Biotage PyroMark ID)；PCR儀(伯樂CFX96)；凝膠成像系統(伯樂C150)；電熱恒溫水浴鍋(NESLAB EX-111)；高速離心機(Thermo LEGND MICRO 21R)；水平電泳儀(伯樂Powed PAC200)；微量分光光度計(Nanodrop ND-1000)；生物粉碎儀(Retsch MM400)。

1.3 實驗方法

1.3.1基因組DNA提取 選取金銀花樣品的完整花蕾，使用生物粉碎儀進行充分研磨，加入CTAB裂解緩沖液(20 g·L-1CTAB，1.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1Na2EDTA)500 μL，65℃進行恒溫水浴裂解30 min，后續DNA提取純化用樹脂型基因組DNA提純試劑盒進行操作。DNA提取后濃度統一稀釋至(50±1)ng·μL-1。

1.3.2SNP位點引物設計 對金銀花及其常見偽品的相關序列進行對比分析，在34、95、110、120、194、568、579、584、599、610、628、633、756、920、929處共15個候選SNP位點，其中633處SNP(A/C)位點能夠區分金銀花及其偽品(圖1)。

圖1 忍冬屬候選SNP位點部分分析結果Fig.1 The analysis results of honeysuckle candidate SNP site

依據前面挖掘的SNP差異性位點設計出2條PCR擴增特異性引物和1條焦磷酸測序引物，引物由上海生物工程公司合成(表3)。

表3 本研究用到的引物序列Table 3 Primer sequence used in this study

1.3.3PCR擴增反應體系及擴增程序 擴增反應體系為(50 μL)：2×GoTaq? Master Mix25 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 2 μL，用滅菌去離子水補齊。反應程序：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環50次；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.3.4測序反應體系及結果分析 測序反應的總體積為100 μL，包括PCR產物50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl，2 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.1% Tween20，pH 7.6)47 μL，10 μmol·L-1測序引物1.2 μL，Annealing Buffer(20 mmol·L-1Tris-AC，2 mmol·L-1MgAc2，pH 7.6)38.8 μL；測序時間8～10 min。

測序完成后使用“SNP”模式對標志性核酸位點進行分析，通過觀察第2個測序堿基“T”和第3個測序堿基“G”的光信號，系統自動對該位點進行分型，其中 “G/G”代表樣品為金銀花正品，“T/T”代表樣品為金銀花偽品。

測序完成后使用“AQ”模式對標志性核酸位點進行分析，通過觀察第2個測序堿基“T”和第3個測序堿基“G”的等位基因頻率判定測試樣品中金銀花含量中的摻偽量，其中“T”堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，“G”堿基頻率為樣品中金銀花正品的含量，“T”和“G”百分含量的和為1。

2 結果與分析

2.1 金銀花與山銀花標準品PCR結果

用金銀花和山銀花標準品的基因組DNA為模板，對差異性SNP位點進行PCR擴增，擴增結果顯示(圖2)，PCR擴增產物電泳條帶大小一致，與預期大小相符，電泳條帶單一、清晰、明亮且沒有二聚體產生，說明設計的PCR引物位點和擴增效率較好，模板和PCR體系正常。其中，A1-A16均有擴增產物，條帶清晰明亮，說明PCR引物位點和主產區金銀花SNP位點擴增效率較好；B1-B15中有的沒有擴增產物或是條帶模糊，說明差異性SNP位點沒有擴增出來。

2.2 金銀花與山銀花標準品SNP差異性位點焦磷酸測序分析

焦磷酸測序技術是一種基于化學發光反應定量測定引物延伸副產物焦磷酸鹽(PPi)的測序技術。產生的光信號強度與聚合的測序模板量和堿基數成正比，依據加入的dNTP類型和測得的光信號強度就可以實時記錄模板DNA的核苷酸序列。以金銀花及山銀花標準品的基因組DNA為模板，對差異性SNP位點進行PCR擴增及焦磷酸測序分析，短柱形代表一個光信號，表明此處有一個對應的堿基，長柱形代表有兩個相同的光信號，表明此處有兩個相對應的堿基，測序結果見圖3。從圖3中可以看出，金銀花真品的核酸序列為5’-TGGAACCGCT-3’，分型為G/G，而山銀花的核酸序列為5’-TTGAACCGCT-3’，分型為T/T，金銀花偽品(50%)的核酸序列為5’-TT/GGAACCGCT-3’，分型為G/T。第1位堿基C和第4位堿基T為陰性質控位點。

圖3 金銀花與山銀花SNP差異性位點焦磷酸測序結果Fig.3 Schematic results of pyrosequencing on SNP differential loci of honeysuckle and Flos lonicerae

焦磷酸測序通過CCD光學系統即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低和相匹配的堿基數成正比，這樣就可以實時記錄模板DNA的核苷酸序列，金銀花、山銀花(金銀花偽品)及金銀花摻偽品(50%)擴增產物焦磷酸測序結果見圖4。

取部分產地及市場采購金銀花和市場采購含有金銀花中成藥擴增產物進行焦磷酸測序，同時可準備96個樣品的PCR產物，放入焦磷酸測序儀的96孔板中進行測序檢測，其測序結果見圖5。有3個T/T型金銀花偽品，2個G/T型金銀花摻偽品(50%)，其余均為G/G型金銀花真品。

圖5 部分樣品的焦磷酸測序結果Fig.5 The pyrosequencing result of the part of sample

注：標注A1-A16為主產區采集的花組織DNA提取結果, 標注B1-B15的為市場采集的中成藥DNA提取結果。圖2 擴增產物的電泳分析圖譜Fig.2 Electrophoretic analysis of PCR

A:金銀花真品擴增產物的焦磷酸測序結果; B:金銀花偽品擴增產物的焦磷酸測序結果; C:金銀花摻偽品(50%)擴增產物的焦磷酸測序結果圖4 PCR擴增產物焦磷酸測序結果Fig.4 Pyrosequencing results for PCR products

2.3 金銀花摻偽量檢測

用金銀花和山銀花的標準品按照1∶1比例進行充分混合，然后提取基因組DNA作為模板，對差異性SNP位點進行PCR擴增及焦磷酸測序分析,結果見圖6?；旌蠘悠返暮怂嵝蛄袨?’-TT/GGAACCGCT-3’，分型為等位基因頻率為“T”和“G”各為50.0%。通過對15份市場銷售的含有金銀花(或山銀花)成分的中成藥進行PCR擴增和焦磷酸測序，得到部分中成藥成分的焦磷酸測序結果(表4)。中成藥中部分中成藥焦磷酸測序結果見圖7，其中T%代表山銀花的含量，G%代表金銀花的含量。

圖6 金銀花摻偽品(50%)擴增產物的測序結果Fig.6 Pyrosequencing results for honeysuckle falsify (50%)

圖7 部分中成藥焦磷酸測序圖Fig.7 Pyrosequencing diagram for TCM

表4 部分中成藥焦磷酸測序結果Table 4 Pyrosequencing results of TCM

3 討論

3.1 焦磷酸測序技術較其他檢測方法的優點

我國藥用植物種類繁多，基源也比較復雜，基于目前形態學標記的性狀鑒定和顯微鑒定都難以滿足快速、精準的需求，鑒定結果的可靠性較差并且費時費力，理化鑒定主要是以中藥中的有效成分為鑒別對象，主要有色譜鑒別和光譜鑒別等[14]方法，雖能辨明中藥材的真偽優劣，但對于摻雜現象鑒定效果不佳[15]。依賴于PCR 技術的檢測方法主要有隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)[16]、簡單重復序列標記(SSR)、特定序列擴增(SCAR)、限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術(PCR-RFLP)[17-18]、等位基因特異性PCR(AS-PCR)、擴增片段長度多態性(AFLP)及DNA條形碼等[19]，但RFLP、RAPD、AFLP等第一、二代標記技術位點開發難度較大、重復性較差，不易在實踐中得到大規模應用[20]。SSR技術開發成本低且多態性、重復性較好，但單個SSR位點的多態性明顯不足。本方法的金銀花成分摻偽量檢測方法是利用焦磷酸測序技術，結合SNP位點標記技術建立的檢測方法。該方法兼有PCR技術的靈敏性和測序技術的準確性，而且測序平臺一次可檢測96個樣本，能夠與96孔PCR板無縫結合，自動化程度高，操作簡單[21]，在遺傳分析中，提供核酸序列信息的分子檢測技術也是“黃金標準”，而色譜分析法多數情況下須在高溫環境下進行，若待分析產物不能被氣化，則不能用色譜法進行分析，在應用的范圍方面受到一定的限制。

3.2 焦磷酸測序技術可準確讀出金銀花摻偽量

該方法是以焦磷酸測序技術為基礎，對差異性SNP位點進行PCR擴增及焦磷酸測序分析，其中金銀花真品的核酸序列為5′-TGGAACCGCT-3′，分型為G/G，山銀花的核酸序列為5′-TTGAACCGCT-3′，分型為T/T，在SNP(A/C)位點上分析具有很高的準確性。在測量短DNA鏈序列方面，是目前唯一能夠實時得到定量序列結果的分析技術，兼有PCR技術的靈敏性和焦磷酸測序技術的準確性，具有重復性好、自動化程度較高、操作簡單等特點，在3 h之內即可完成金銀花成分中摻偽量的檢測工作，鑒定結果可以從光信號的峰值直接讀出。