二代及三代測序技術在遺傳學診斷中的應用進展

高海明,趙彥艷

中國醫科大學附屬盛京醫院臨床遺傳科, 沈陽 110004

出生缺陷是導致流產、死胎、新生兒死亡和嬰兒死亡的重要原因[1]，我國每年新增的出生缺陷數約90～100萬例，給家庭和社會造成極大的負擔，嚴重影響人口素質[2]。因此，如何有效預防出生缺陷、降低其發生率、增強國民身體素質成為了公共衛生領域的重大課題。21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征是新生兒常見的先天性染色體異常及缺陷疾病，在孕早期進行有效的胎兒染色體異常篩查對于改善孕婦分娩結局及保證嬰兒健康具有重要意義[3-4]。遺傳學診斷是指采用分子生物學技術對受檢者全部或部分基因組信息進行檢測和分析，再結合臨床信息來明確患者的遺傳學病因，為臨床診斷和遺傳咨詢提供指導。常用的遺傳學診斷技術包括核型分析、一代測序、二代測序及三代測序等。1977年，以末端終止法為特征的第一代測序即Sanger測序被發明，其測序讀長可達1 000 bp，結果準確可靠，目前仍作為絕大多數遺傳學測序診斷的金標準[5-6]。但由于Sanger測序依賴于PCR聚合酶和毛細管電泳，其測序成本高、分析速度慢，難以滿足越來越大的測序需求。隨著人類基因組計劃(human genome project，HGP)的完成，通量更高、更經濟的測序技術——高通量測序(high throughput sequencing，HTS)的開發和商業化應運而生。HTS又被稱為二代測序(next generation sequencing，NGS)，與Sanger測序最大的不同的之處在于,NGS可以同時對幾十至幾百萬條DNA短片段進行獨立的大規模平行測序，配合下游的生物信息學分析來實現基因組測序[7]。此外，為了彌補NGS讀長較短的問題，第三代測序技術也初露鋒芒，憑借其長讀長的獨特優勢在臨床應用中占據一席之地。多種測序技術各有特點，互為補充，共同為遺傳學診斷提供了有力的檢測手段[8]?；诖?，本文對二代及三代測序技術的原理、分類及其在臨床遺傳學診斷的應用進展做一綜述，以期為臨床測序方案的選擇提供思路和指導。

1 二代及三代測序技術的原理和分類

1.1 NGS原理與分類

高通量測序原理為合成測序(sequencing by synthesis，SBS)，是Sanger測序的進一步發展，主要步驟包括基因組打斷、建庫和測序。首先將待測DNA分子打斷為長約幾十到幾百bp的片段，將其分散至數百萬個反應孔中或固定于芯片上，經過PCR或等溫擴增技術進行DNA預擴增反應，并通過檢測帶不同熒光標記的核苷酸或反應副產物來提供基因組信息[9]。

目前絕大部分NGS平臺均采用SBS，但不同平臺的核心技術有所區別，如Roche(焦磷酸測序)[10]、Illumina(橋式PCR)[11]、Ion PGM(半導體H+測序)[12]以及華大智造研發的首個國產測序平臺BIGSEQDNA(納米球測序)[13]。Roche 454焦磷酸測序是最早出現的二代測序系統，是通過檢測DNA合成反應時釋放的焦磷酸(PPi)來讀取堿基信息。微乳液PCR(emulsion PCR，emPCR)可以將單個DNA片段與磁珠鏈接，磁珠被小油滴包被后進行獨立的擴增，使每個磁珠上均為同一DNA片段的數百萬個拷貝簇。每一輪堿基合成反應時只加入1種dNTP，如果它剛好能與模板匹配，則會合成到引物3′端，釋放出與光反應偶聯的PPi從而實現測序[10-11]。Roche 454焦磷酸測序讀長最長，但成本較高，目前其配套的測序儀已停產，退出了主流的二代測序市場。

目前，Illumina占據了二代測序市場的絕大部分份額，其核心技術為橋式PCR和可逆終止子技術，即將基因組打斷、變性為單鏈，通過與芯片表面的引物堿基互補被固定于芯片上，形成“橋”，經過PCR反應使每個分子獲得了1 000倍擴增，成為單克隆DNA簇。測序反應時加入帶有4種熒光標記的dNTP“可逆終止子”[14]，通過切割其3′羥基末端的特殊基團使聚合反應反復起始和終止，并記錄熒光信號以得到序列信息。與照相機成像檢測相比，帶有熒光標記的堿基可以直接成像從而提高檢測速度[11]。Ion Torrent半導體測序技術的出現拓展了測序市場，其配套測序儀Ion PGM是目前市場上最便宜的測序儀，可將核苷酸序列直接轉換為半導體芯片上的數字信息。DNA合成反應中會釋放出H+導致溶液pH變化，該平臺利用離子傳感器將溶液pH的變化記錄為堿基信息，在該過程中不使用熒光或化學發光，不需要相機、光源或掃描儀，因此大大加快了測序過程，使Ion Torrent成為二代測序市場上的新流行[12]。

華大智造作為后起之秀，開啟了國產測序儀的高通量時代。其測序平臺BGISEQ的獨特之處在于文庫構建過程，在建庫時基因組DNA被打斷、變性、環化為單鏈環狀，利用DNA分子滾環擴增技術(rolling circle amplification，RCA)用以制備DNA納米球(DNA nanoballs，DNBs)，并使用聯合探針錨定聚合技術(combinatorial probe-anchor synthesis，cPAS)使測序引物錨定分子和熒光探針在DNA納米球上進行聚合反應，利用高分辨成像系統對光信號進行采集從而獲得序列信息[13,15]。華大已推出了多種不同通量的測序儀供用戶選擇，并且配套有相應的自動化樣本制備系統，對于臨床檢測來說具有極大的優勢[16]。上述不同NGS平臺的比較見表1。

表1 不同NGS平臺對比Table 1 Comparison of characteristics of different NGS platforms

1.2 三代測序的原理與分類

與二代測序技術相比，三代測序不需要經過PCR擴增，并且可以實現超長讀長測序。目前市場上可供選擇的三代測序技術主要有兩大平臺：PacBio公司開發的單分子實時測序(single molecule real-time，SMRT)技術[17]和納米孔單分子測序技術(Oxford nanopore technologies，ONT)[18]。SMRT技術可以實時記錄被熒光標記的脫氧核苷酸的強度變化，這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一致[19]。較之二代測序，SMRT測序速度很快，每秒約10個dNTPs，但是通量低，1個SMRT芯片池上有150 000測序單元，但是只有35～70 000個發生有效測序；另外SMRT的連續堿基序列(continuous long read，CLR)錯誤率高達11%～15%，但是不同于NGS偏向性的錯誤，SMRT測序錯誤是隨機的，可以通過足夠的測序次數來糾正，15次測序CLR準確率超過99%[17]。ONT是采用電泳技術驅動單個分子逐一通過納米孔，根據A、G、C、T這4種堿基的帶電性質不同，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實現測序[20-21]。ONT單堿基錯誤率高，為隨機錯誤，但可通過提高測序深度進而提高堿基準確率。相比于二代測序，長讀長是三代測序的關鍵優勢，而通量低、錯誤率高、單堿基成本高是三代測序的缺陷[22]。對于臨床檢測可以采用二代測序高通量和準確度高的短讀長片段對三代測序的長讀長片段進行修正[23]，目前三代測序特別適合于全基因組denovo測序、甲基化研究、點突變檢測、特殊基因區域檢測等[24-27]。

2 二代及三代測序技術在遺傳學診斷中的應用

以高通量測序技術、三代測序技術為代表的現代分子生物學技術在遺傳學領域的推廣應用，正在逐漸改變醫學遺傳學的現狀，無創產前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)、染色體拷貝數變異檢測、單基因病的篩查和診斷都是其應用領域。研究人員或臨床醫師可以根據不同的檢測需求選擇適合的測序方案，以提高疾病診斷率，為遺傳病家庭帶去福音，實現社會資源的最大化利用。

2.1 NGS在NIPT的應用

2.1.1胎兒染色體非整倍體異常 早在1997年，就有科學家證實婦女在懷孕期間其外周血循環有胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)的存在[28]；2008年Quake團隊報道了cffDNA-NIPT技術(cffNIPT)，該方法基于高通量測序平臺對孕婦外周血中的cffDNA進行低深度全基因組測序，并結合生物信息學分析方法，完成了胎兒13/18/21號染色體非整倍體檢測[29]，自此基于cffDNA的NIPT開始在臨床中應用。目前，NIPT作為孕期常規篩查手段用于上述常染色體及性染色體非整倍體的篩查[30]。國內主流的三大NIPT平臺為：達安DA8600(基于Ion Proton測序平臺)、貝瑞和康NextSeq CN500(與Illumina合作生產)以及華大基因的BGlSEQ500。大規模人群研究證實NIPT對于13/18/21號染色體拷貝數異常的檢測特異性均大于99.9%；檢測敏感性方面T21最高，可達到99.5%，T18為93.1%，T13敏感性略低，為92.7%[31]。多項研究均證明NIPT對于T13/18/21檢出的準確率均高于傳統血清學篩查[32]，是一種更適合于高危人群的產前篩查的選擇；而對于大眾群體來說，NIPT的檢測成本與實際效果還需要從政府、社會和個人角度等進一步明確[33-34]。

2.1.2胎兒染色體微缺失和微重復 染色體亞結構異常(微缺失和微重復)會導致胎兒的身體或智力發育嚴重異常，在大約6%的B超結果異常和1.7%的高齡或唐氏綜合征篩查陽性的孕婦中存在染色體微缺失和微重復，且其發生率與孕婦年齡無明顯相關性[30]。因此，對所有年齡段孕婦均應在產前行胎兒染色體微缺失和微重復檢測。近年來,NIPT也被用于染色體微缺失微重復疾病的篩查[30]。張春花等[35]對國內三大NIPT平臺染色體微缺失、微重復檢測效果進行評估，從數據量、陽性預測值、假陽性率方面比較后發現，BGISEQ500有效數據量和陽性篩查率明顯高于DA8600和NextSeq CN500，三大平臺的陽性預測值沒有顯著差異。隨著高通量測序的發展和優化，單樣本的檢測成本在不斷下降，對人類基因組變異與疾病間關系的進一步明確和深入，最終以NIPT取代血清學篩查是產前篩查發展的必然趨勢，并且NIPT在微缺失/微重復綜合征篩查方面的應用將會更加廣泛。

2.1.3胎兒單基因病 單基因病無創產前篩查也是NIPT的重要研究方向，已有亨廷頓舞蹈病、地中海貧血、囊性纖維化、肝豆狀核變性、杜氏肌營養不良的NIPT報道[36-39]。Wang等[40]針對α/β地中海貧血的無創產前檢測開發了一套針對HBA1、HBA2和HBB基因的SNP探針，收集地中海貧血家系的gDNA及胎兒游離DNA并對目標區域靶向測序，使用隱馬爾科夫模型(hidden Markov model，HMM)和Viterbi算法構建親本單體型來分析胎兒基因型，從而完成地中海貧血家系的產前診斷?；诙鷾y序平臺的單基因病NIPT需要依賴生物信息學的算法，如相對突變劑量(relative mutation dosage，RMD)和相對單倍劑量(relative haplotype dosage，RHDO)，來構建親本、先證者以及胎兒單倍型來對連鎖位點進行檢測[41-42]，其準確性還需要更多人群的大規模驗證，對于臨床應用的實際效用尚需謹慎討論。另外，采用10×genomics測序進行長讀長測序也是單基因病NIPT研究的重要手段。Jang等[39]采用10×genomics靶向linked-reads測序技術，將單個長片段的DNA分子分配至不同的油滴中，并通過GEM建庫技術，將長片段DNA切割成適合測序的大小，并且來源于相同油滴(同一條長片段DNA)的DNA片段會帶上相同的DNA序列標記(barcode)，經測序拼接后理論上可以得到原先的長片段DNA序列。研究人員收集了5名DMD突變攜帶者孕婦的血漿DNA并進行靶向linked-reads測序分析，最終成功判斷胎兒基因型以及目標區域的染色體重組情況。該方法能夠提示DMD基因大片段缺失、重復，可以直接對胎兒游離DNA進行單倍體分析而無需對先證者gDNA測序，但其建庫費用十分昂貴，檢測周期更長(3周)，而且單基因病NIPT的臨床適用性研究較少，該方法最終是否可以在臨床上推廣應用還需進一步探討。

2.2 NGS在染色體病診斷中的應用

我國每年約有10萬染色體異?；純撼錾?，每1 000個活產嬰中就有5～10個發生染色體異常[43]。在基因測序出現之前，臨床上針對遺傳病主要是在細胞水平對染色體行G顯帶核型分析，該方法可以直觀地觀察染色體數目及結構變異，是檢測染色體異常的金標準[44-45]。然而，核型分析細胞培養耗時長、效率低，而且僅能分辨5～10 Mb以上大小的結構變異，對染色體的微缺失、微重復的分辨不足，且不能精確定位變異染色體位置和大小。低深度全基因組測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)的出現彌補了核型分析分辨率不足的缺陷[46]，是高通量測序在染色體拷貝數變異檢測中的重要應用。CNV-seq通過低深度全基因組測序及下游生物信息學分析對染色體拷貝數異常檢測，分辨率可達100 kb。Zhang等[47]對160名妊娠高風險或遺傳病高風險人群進行CNV-seq分析，結果顯示近一半(44.6%)的高危妊娠孕婦檢出染色體異常，不良孕產史和遺傳病家族史個體中檢出染色體異常的比例更高，分別為67.6%和55%。鑒于CNV-Seq對于染色體微缺失、微重復檢測的高度特異性和一致性，其已逐漸成為了診斷染色體病的首選方法[48]。目前臨床上已將CNV-seq用于染色體病的產前診斷、攜帶者篩查以及植入前遺傳學診斷[35]。

2.3 NGS及三代測序在單基因病診斷中的應用

NGS按照其對基因組的檢測范圍可分為靶向測序(target gene sequecing，TGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)、全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)。TGS是通過選取部分與待檢疾病密切相關的基因進行目標區域富集測序，單次檢測價格更為低廉，易被患者所接受，在內分泌疾病、神經肌肉病等系統性疾病中應用較多。WES是利用序列捕獲技術將全外顯子區域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因分析方法，其對遺傳性疾病的臨床分子診斷率約為25%～50%[49-51]。由于外顯子組序列約占人類全部基因組序列的1%，但其包含了大約95%的致病突變[52]，因此目前對于大部分單基因遺傳病來說，WES是最具性價比的NGS手段，而且WES具有可回溯性，隨著疾病與基因之間的關聯認知逐漸深入，WES數據的重分析對于指導臨床診斷具有極大的價值。WGS是對人類所有基因組信息(包括蛋白質編碼區以及大量非編碼區)進行測序，具有測序面廣、檢測基因變異類型全等優點，但過高的價格限制了其在臨檢中的應用，目前主要用于科研用途。這3種方式各有利弊，在臨床中應根據每種測序技術的特點和局限性以及臨床目的來選擇最適合的測序策略。

按照單基因病的致病機制，可將基因組序列變異類型分為單核苷酸變異(single nucleotide variant，SNV)、結構變異(structural variants，SV)、拷貝數變異(copy number variations，CNV)、插入/缺失(insertion-deletion，InDel)以及動態突變、甲基化異常等。NGS尤其適合于SNV及InDel的檢測，但受限于其技術特點，NGS對于高GC含量或堿基高度重復區域的檢測并不準確，因此對于特殊致病機制的單基因病，例如動態突變的檢測，可以采用三代測序以彌補NGS的缺陷。對于發生于基因組外顯子區或明確靶區域的SNV或InDel，可以選擇WES或TGS；發生于全基因組的SNV、InDel可以選擇WGS[53]；對于復雜的染色體平衡異位或SV、CNV，NGS并非最佳檢測手段，應首選染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)、核型分析或CNV-Seq以明確發生變異的染色體，再根據細胞遺傳學結果和臨床需要考慮采用WGS或三代測序進行斷點分析。

2.3.1SNV、Indel的檢測 對于臨床診斷較為明確、致病基因有限或突變機制復雜的單基因病，應用TGS能夠保證足夠的測序深度，不僅能夠反映SNV、Indel，還能一定程度上檢出CNV等復雜致病變異[54]，使臨床檢測具有更高的針對性；對于臨床癥狀不典型、難以確診的遺傳病，WES較TGS有更大的覆蓋范圍，能從全外顯子組的水平對基因功能區進行評估，有利于快速地診斷。先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)是一種常見的新生兒內分泌疾病，其中甲狀腺發育異常是造成CH的最主要原因，孔靜等[55]針對甲狀腺發育異常相關致病基因的熱點突變的外顯子及外顯子-內含子交界區域設計靶向panel，對89例CH患兒進行檢測，最終有19例患者檢出潛在致病突變，17例為TSH基因突變，其中有4個為新發突變。WES尤其適合單基因病的SNV、Indel的臨床檢測，其可回溯性對于提高臨床診斷率具有重要作用。此外，有研究者對比了WES和WGS在SNV和Indel的檢測中的表現，發現兩者都檢出了編碼區域中超過96.0%的高質量SNV和78.0%的高質量Indel，但是在SNV檢測方面WGS比WES更為強大，其假陽性率分別為17%(WGS)和78%(WES)，而且從覆蓋深度(coverage depth，CD)、基因型質量值(genotype quality，GQ)和低覆蓋區域比例(minor-read ratio，MRR)等參數的總體分布來看，WGS能夠提供更為優質均一的測序質量[56]。

2.3.2CNV的檢測 WES和WGS可以從基因組全局水平提示基因組大片段CNV，該優勢可以提高致病位點檢出率。Pfundt等[57]對2 603例遺傳性疾病患者的WES 數據進行分析，最終確定了123個致病性CNV，大小從727 bp到15.3 Mb不等，總體診斷率提高了約2%。隨著對基因與疾病認識的不斷深入，相關數據庫也在更新和完善，未明確診斷的患者的WES數據重分析對于提高臨床診斷率也不容忽視。Ewans等[58]對來自37個家系共54名遺傳病患者的WES進行了重新分析以鑒定其遺傳病因，包括對患者表型的準確分析、內部變異數據庫檢索以及新疾病基因的鑒定，最終明確了4個家系的遺傳學病因，整體診斷率由最初的30%提高到41%。另外從成本效益角度分析，WES與傳統診斷手段相比可以大大節省遺傳病的診斷成本。研究人員建議對于遺傳病患者應盡早進行基因組測序，以便為后續疾病診斷、治療乃至生育指導提供依據。

2.3.3SV的檢測 結構變異(structural variants，SV)的鑒定對于疾病的遺傳學診斷也尤為重要，約有5%～20%的遺傳病由SV致病[59-62]，核型分析和染色體微陣列雖然價格低廉，但不能檢出準確的斷點信息以及小片段SV。理論上WGS能提供全部基因組信息，Currall等[63]開發了一種針對大片段SV(>5 000～10 000 bp)的特殊WGS建庫技術——large inserts文庫(large inserts libraries，liWGS)來最大程度地提高覆蓋率。染色體平衡異常(balanced chromosomal abnormalities，BCA)常用核型分析和CMA來檢測，有研究表明有多達40%的BCA可以被CMA作為非平衡異常而檢出，因此對于復雜結構變異或平衡異常，可以通過傳統細胞遺傳學手段檢測后再采用liWGS進一步分析斷點信息，提高SV檢出率。Redin等[64]對273名預先經過CMA確認的BCA患者采用liWGS測序，最終有90.8%患者明確了其平衡異常的斷點，但有9%的斷點無法檢出。

隨著測序技術和分析能力的提高，三代測序通過長讀長檢測可以直接反映基因組結構變異，成為了SV鑒別的重要手段。Stancu等[65]使用MinION納米孔測序儀和NanoSV算法分析了2名具有復雜表型的先天性異?；颊呋蚪M，其中對于2號患者檢出了29個新發SV，提示了1、5和9號染色體的復雜重排，與46,XY,t(1;9;5)(complex)dn相吻合，該研究證明，可以利用納米孔測序來確定染色質斷點的親本起源，其在新發染色質重排檢測方面優于NGS。

2.3.4動態突變的檢測 隨著基因檢測技術的發展，三代測序技術的應用逐步提升，目前有研究將其用于全基因組短串聯重復變異檢測。脆性X綜合征(fragile X syndrome，FXS)是遺傳性智力障礙和自閉癥的最常見原因之一，是由FMR1基因(CGG)n區域重復次數過多(大于200次)而致。該區域為大量GC堿基重復，短讀長的NGS對位于此類區域的讀取表現不佳，為了解決該問題，Loomis等[59]采用SMRT技術對FXS患者FMR1基因(CGG)n區域進行檢測，并且最終完成了長達2 kb的(CGG)n重復片段鑒定，其檢出的重復數高達750次。不同突變類型的檢測方式及測序平臺選擇見表2。

表2 不同變異類型的檢測方式及測序平臺選擇Table 2 Detection methods and sequencing platform selections of different variations

3 展望

自NGS發明以來，相應的測序平臺不斷推陳出新，技術平臺的優化和成本的急速降低促成了其在臨床檢測應用的不斷擴大。NGS技術極大地推動了精準醫學的發展，全面地改變了遺傳學領域的發展面貌，也使遺傳學分子診斷迎來了一個新的技術時代。然而，不斷增加的測序需求量也對NGS平臺的硬件及軟件提出了更高的要求，對人類基因組測序的能力已大大超過遺傳變異的解讀能力，冗余的測序數據對數據管理、分析及變異解讀、數據庫的建立及更新提出了嚴峻的挑戰[66]。NGS產生的大量原始序列數據依賴于生物信息學的分析，因此，生物信息技術對于NGS起著至關重要的作用。主要生物信息分析步驟均包括原始數據的質量控制、數據對比、對比后處理、變異識別、注釋、過濾及解讀，不同的NGS平臺所產生的測序數據類型有一定的差異，如Illumina和華大BGISEQ平臺產生的測序數據主要包含序列信息和相應的堿基質量值，而Ion Torrent平臺產生的測序數據除了以上信息外，還包含測序堿基信號值(flow signal)[12]。目前，應用于臨床基因檢測的生物信息學分析流程都是實驗室內部自建或第三方服務商提供，不同的測序平臺和測序范圍的數據分析流程及所使用的軟件有所差別，為了保證檢測的準確性和可靠性，各個實驗室在建立生物信息分析流程時，需要設置必要的質控標準包括reads質量、GC含量、比對率、reads比對質量以及測序深度，還要明確檢測范圍、準確度、分析敏感性、特異性等來確認生物信息分析的性能，以保證達到預期的檢測目的[67-68]。

NGS在不同領域的應用標準、倫理問題及檢測后的遺傳咨詢規范等也需要進一步探討和完善[69]，2017年唐北沙等[53]制定了符合我國現實情況的人類孟德爾遺傳性疾病基因組序列變異解析規范，從臨床資料采集、二代測序選擇、質控管理、生物信息分析、變異解讀原則及倫理學等方面對于遺傳病的變異解讀進行了詳細的闡述。NGS的高速發展伴隨著機遇和挑戰，隨著其技術的不斷升級優化和臨床經驗的不斷積累，通過不同領域專家共同協作以建立更加精準的“基因-疾病”解讀指南是未來遺傳學檢測的發展方向，NGS終將會成為遺傳學領域主要且常規的檢測手段。

三代測序是人類遺傳學領域的重要里程碑，其特別適合于復雜的基因組組裝、串聯重復以及復雜的結構重排、單倍型構建等，但高昂的價格限制了其在常規臨檢的應用，目前僅用于科研用途。三代測序技術在讀取的準確性、相應的分析算法以及檢測成本方面需要進一步優化和提升，在未來可以與NGS互為補充，為臨床遺傳學服務[70]。