核酸層析法轉基因快速檢測體系的建立及應用

任雯,楊海俠,陳立柱,李雨峰,劉亞*

1.北京市農林科學院玉米研究中心, 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097; 2.寶瑞源生物技術(北京)有限公司, 北京 102433

自1996年商業化轉基因作物面世以來，全球農業轉基因技術的應用迅猛發展，轉基因作物的種植面積逐年快速擴大，批準國家迅速增加[1]。2018年全球轉基因作物種植面積已達1.917億hm2[2]，是1996年的113倍，占全球15億hm2耕地面積的13%左右，全球商業化應用轉基因的國家或地區已增加到70個[3]。其中，我國憑借290萬hm2的轉基因作物種植面積位列全球第7位。我國對轉基因技術的發展也持續高度重視與支持，發展農業轉基因技術是我國的國家戰略要求，而轉基因檢測作為轉基因研究體系中重要一環，重要性日益凸顯，因此，開展轉基因快速、高效分子檢測方法的研發具有重要的生產實踐及科研意義。

一般轉基因作物的檢測分為核酸水平檢測和蛋白質水平檢測，常用檢測方法有PCR、Southern雜交、Northern雜交、Western雜交等，其中，PCR技術是核酸水平檢測外源基因的主要手段[4-5]。核酸檢測的分子生物學方法一般包括3個步驟：核酸提取、核酸擴增和核酸檢測。目前，普通PCR檢測方法是我國轉基因植物檢測的核心技術，但該方法對實驗條件要求較高，需要配備劃分不同功能區域的大面積實驗空間、大量專業實驗儀器，且需完成核酸提取、PCR擴增以及電泳等實驗流程才可進行檢測結果判讀[6]。為提高基于PCR檢測方法的效率，研究人員從加速或省略核酸提取步驟、提高PCR反應效率及提高結果檢測效率等環節優化檢測流程，如趙冰兵等[7]使用一種直接PCR的方法進行轉基因檢測，通過省略核酸提取步驟從而對檢測步驟進行簡化；而武海斌等[8]建立的一種基于基因芯片的多重PCR檢測方法以及金蕪軍等[9]用復合PCR方法對6種轉基因玉米中的外源DNA片段和玉米內參照基因(Zein)進行特異性檢測，均基于多重PCR方法提升了檢測效率；此外，劉亞等[10]對3種不同核酸分析系統的效率進行了比較并對其不同適用范圍和優缺點進行了總結分析，提出了對PCR結果判讀流程的優化方案。

蛋白質水平檢測方面，目前常用的是基于膠體金技術的蛋白試紙條方法。膠體金免疫層析技術(colloidal gold immunochromatography assay，GICA)是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析技術相結合，是19世紀80年代繼三大標記技術(熒光素、放射性同位素和酶)后發展起來的固相標記免疫測定技術[11]。最初該方法僅用于免疫電鏡技術，現在已經發展到應用于光鏡染色、免疫印跡以及免疫層析技術等領域[12]。這類試紙條檢測的特點是更加便捷，但存在適用范圍窄的缺陷，目前主要適用于轉基因植物的大田和原材料的快速初篩。

核酸層析技術是基于膠體金技術發展而來的一種新的檢測方法，通過結合常規PCR與核酸膠體金層析技術，針對標記基因的核苷酸序列設計特異性引物，并對引物序列進行地高辛和生物素標記，然后對試樣DNA進行PCR擴增，再對擴增產物進行膠體金檢測，最后根據膠體金檢測是否顯色，判斷樣品中是否含有待測成分[13]。本研究采用一步法獲取玉米、大豆、水稻等樣本的核酸作為檢測模板，分別使用內參基因、轉基因元件、轉入外源基因及事件特異性檢測引物進行PCR擴增，再使用核酸層析法試紙鑒定檢測結果，旨在研發一種新的基于核酸檢測又可利用試紙條一步查驗結果的轉基因檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用實驗樣本均由本實驗室保存，具體材料及品種名稱為：非轉基因玉米樣品：京科968(用于進行內參基因ZSSⅡB、Zein的檢測，并作為各類轉基因元件、外源基因及事件特異性檢測及大豆、水稻內參基因檢測的陰性對照)；轉基因玉米樣品：Bt11(作為內參基因ZSSⅡB、Zein、啟動子CaMV35S、終止子NOS、抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑基因Pat及轉基因事件Bt11檢測的陽性對照)；Mir604(作為選擇標記基因Pmi及轉基因事件Mir604檢測的陽性對照)；Bt176(作為抗除草劑基因Bar檢測的陽性對照)；NK603(作為抗除草劑基因CP4-EPSPS檢測的陽性對照)；Mon863(用以作為選擇標記基因NPTⅡ檢測的陽性對照)；大豆樣品：選用黑河12，用于進行大豆內參基因SPS的檢測；水稻樣品：選用日本晴，用于進行內參基因Lectin的檢測。

1.2 主要試劑及儀器設備

DNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP混合液購自北京全式金生物技術有限公司；膠體金檢測試紙條由寶瑞源生物技術(北京)有限公司生產；引物由北京擎科生物技術有限公司合成。

PCR儀選用C1000 Touch PCR系統(美國Bio-Rad公司)；分光光度計選用Nanodrop 1000分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 標記基因及選用引物

本研究選擇了內參基因、轉基因元件、轉入外源基因及事件特異性檢測這4類檢測項目進行實驗分析。內參基因用以區分作物種類并判別檢出結果的有效性；對常用的抗蟲、抗除草劑及選擇標記基因等進行檢測，以證實本方法同時具備與蛋白水平檢測相同的檢出效果。此外，還選擇了轉基因元件及事件特異性檢測這2類僅用PCR等核酸檢測才可檢出的檢驗項目，用以判定本方法在核酸檢測中的特異性和有效性。對引物進行整理、篩選和優化，最終確定其中一套引物用于檢測(表1),引物序列均出自農業農村部轉基因檢測的相關文件[14-18]。

表1 轉基因檢測引物Table 1 Primers for genetically modified maize

1.4 樣本處理

將轉基因種子、植物葉片、莖稈過根系等材料，液氮冷凍研磨成粉狀，每種樣品取30 mg加500 μL ddH2O，使用移液槍多次吹吸混勻，靜置5 min備用。

1.5 一管法DNA提取

取5 μL核酸釋放劑(100 mmol·L-1氯化鉀；0.5 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl；1%曲拉通100；1% SDS；5 mg·mL-1蛋白酶K)，加入PCR反應管中；取1.4制得的待測樣本5 μL加入對應的PCR反應管中，并用移液器在管底吹打混勻10次；每管加30 μL無菌石蠟油備用。將制備好的包含待測樣品及石蠟油的PCR反應管放置在PCR儀中進行裂解反應，反應程序為：95 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min。

1.6 PCR方法

向1.5所獲得的裂解樣品的PCR反應管中依次加入：10×PCR Buffer 5 μL，du dNTP混合液1 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.3 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 27.4 μL，并混勻。其中，10×PCR buffer含有0.1% DMSO、3%～5% BSA、100 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl。將PCR管放到離心機上，于500～1 000 g離心10 s，然后取出PCR管，放入PCR儀中，PCR反應程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸45 s，共40個循環。

1.7 PCR產物膠體金檢測

取35 μL 1.6中的PCR反應產物加入膠體金檢測卡(膠體金核酸層析試紙條包含樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、膠體金檢測線、質控線和吸水墊，具體見圖1A)，等5～10 min觀察顯色狀況(期間根據膠體金卡層析情況，可以加入少量超純水加快層析)，根據顯色卡讀取各樣品顯色級別。一般設置0～10檔， 0為全陰性，10為強陽性，中間梯度遞增；10+表示T線顏色深于標準色卡最強的10檔。當膠體金檢測T線和C線出現肉眼可見顯色，表明樣品含有轉基因成分，結果表述為“樣品檢檢出轉基因成分(或目的基因成分)，檢測結果為陽性”(圖1B)；而膠體金檢測T線未出現肉眼可見顯色，C線出現肉眼可見顯色，表明樣品不含有轉基因成分，結果表述為“樣品檢未檢出轉基因成分(或目的基因成分)，檢測結果為陰性”(圖1C)。

A：膠體金核酸層析試紙條層析設計原理圖；B、C：檢測結果判定示意圖。圖1 膠體金核酸層析試紙條層析設計原理及檢測結果判定示意圖Fig.1 The schematic diagram of colloidal gold nucleic acid chromatography strip and the detection result

2 結果與分析

2.1 內參基因檢測

將玉米內參基因ZSSⅡB及Zein、大豆內參基因SPS、水稻內參基因Lectin的擴增產物滴加到膠體金檢測卡。將ZSSⅡB基因的PCR擴增產物滴于試紙上，顯色L8、L10+，Zein基因檢測顯色L9、L10+，表示這2個樣品為玉米樣品，而空白樣本(不含待測樣品DNA的反應體系)無顯色，表示空白樣本中不含玉米成分(圖2)。同樣，檢測水稻樣本中的SPS基因顯色可以達到L10以上，表示該樣品為水稻樣品，而陰性對照非轉基因玉米樣品無顯色則表示該樣品不含水稻成分(圖2)；大豆樣本內參基因同樣顯色度可達L10以上，表示該樣品為大豆樣品，陰性對照非轉基因玉米樣品無顯色表示不含大豆成分(圖2)。各內參基因檢測結果良好，空白樣本及陰性對照均無顯色。其中ZSSⅡB基因檢測玉米樣本顯色L8、L10+；Zein基因檢測玉米樣本顯色L9、L10+；水稻SPS基因檢測水稻樣本，顯色可以達到L10以上；而大豆內參基因檢測大豆樣本，顯色亦可達L10以上；且在玉米樣品中未檢出水稻和大豆的內參基因?？梢娫摲椒捎糜诟黝愖魑锏膬葏⒒驒z測，且特異性較好，不僅可用于實驗對照結果及樣品狀態是否達標、核酸提取是否有效等檢測結果有效性的判定，并可用于判定檢測作物物種。

注：空—空白對照；NC—陰性對照。圖2 玉米、水稻、大豆內參基因檢測結果Fig.2 Detection results of maize, rice and soybean internal genes

2.2 轉基因元件檢測

將轉基因元件啟動子CaMV35S及終止子NOS的擴增產物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應體系為空白對照、非轉基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。由圖3可知，CaMV35S及NOS檢測陽性樣本T線及C線均存在明顯條帶顯色，且顯色度均達到L10以上，表明結果檢測結果為陽性，即該樣品檢出轉基因成分；而空白對照和陰性對照中T線均未出現肉眼可見顯色，而C線出現明顯顯色，表明檢測結果為陰性，即該樣品不含有轉基因成分。由此可見，轉基因元件檢測結果良好，證明該方法可成功檢出各類轉基因元件。

2.3 外源基因及特異性轉基因事件檢測結果

將抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑Bar、Pat、CP4-EPSPS及選擇標記基因NPTⅡ、Pmi等外源基因的擴增產物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應體系為空白對照、非轉基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。Cry1Ab/1Ac基因、NPTⅡ基因、Pmi基因、Pat基因檢測結果中，陽性樣本的T線和C線均出現肉眼可見顯色，顯色均在L10以上，表示成功檢出上述基因；而陰性對照及空白樣本T線未出現肉眼可見顯色，C線出現肉眼可見顯色，表示未檢出轉基因成分(圖4)。這幾類基因的檢測顯色對比度較強，顯色強度較高，實驗效果突出。而Bar基因、CP4-EPSPS基因檢測結果中，陽性樣本顯色在L9以上，陰性對照及空白樣本無顯色(圖4)，也達到了可清晰辨識的檢測結果要求。以上結果表明本方法可成功檢出各類外源基因，結果特異性強、辨識度高。

將特異性轉基因事件Mir604、Bt11的擴增產物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應體系為空白對照、非轉基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。Bt11及Mir604這2個轉基因事件經由特異性引物檢測的結果判讀均有L10+的顯色度，同時不含對應轉基因事件成分的陰性對照及空白對照T線均無顯色(圖4)，可見該方法對事件特異性檢測的結果判讀清晰準確無誤。

注：NC—陰性對照；空—空白對照。圖3 CaMV35S啟動子及NOS終止子檢測結果Fig.3 Results of CaMV35S promoter and NOS terminator detection

3 討論

隨著全球越來越多的轉基因植物商業化生產應用，各國對轉基因產品管理與標識制度也隨之日益完善，因而對轉基因檢測工作提出了更高的要求。為適應不斷變化的市場和監管需求，發展轉基因產品檢測技術的關鍵就在于如何建立更高效、更高通量、更快速、更準確的轉基因產品檢測方法[19]。常用的蛋白質水平檢測基于膠體金蛋白試紙技術，但是由于有些轉基因樣品蛋白質可能發生表達不完整、蛋白質降解、折疊變構等情況，均有可能造成假陰性結果。且該方法適用范圍較窄，如啟動子及終止子等轉基因元件均無法檢測，也無法進行特異性轉基因事件判定，目前主要用于轉基因植物的大田和原材料的快速初篩[20]。PCR方法是基于核酸水平的檢測，但該方法對實驗設施和條件要求較高，且比較費時，提取DNA這一步驟所用時間也是制約PCR檢測效率和速度的一個主要環節[21]。

本研究提出了一種基于核酸層析法的轉基因檢測新方法，可特異性的檢測出陽性轉基因樣品中抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑基因Bar、Pat、CP4-EPSPS及選擇標記基因NPTⅡ、Pmi等外源基因，還可檢出不同種類作物的內參基因，包括玉米內參基因ZSSⅡB及Zein，水稻內參基因SPS及大豆內參基因Lectin[22-23]，且不同種類作物間內參基因檢測特異性良好，無交叉反應。此外，一般試紙條檢測法無法判讀的轉基因元件(例如CaMV35S啟動子及NOS終止子)，及轉基因事件檢測(Bt11及Mir604)也均獲得了L9以上的清晰明顯的顯色，可明確判定出陽性樣品?？梢娫摍z測方法無論是在內參基因、轉基因元件、外源插入基因乃至轉基因事件的檢測中，均可準確、特異性的進行結果判讀。表明本方法可取代常規PCR檢測方法，覆蓋常用作物轉基因檢測項目并進行有效檢測結果判定。

注：NC—陰性對照；空—空白對照。圖4 外源轉入基因及事件特異性檢測結果Fig.4 Detection results of exogenous gene transfer and event specificity

本研究將PCR檢測與試紙條檢測方法的優勢進行聚合，通過省略了DNA提取步驟和簡化檢測讀取步驟，大大縮減了PCR檢測流程及所耗時間，且檢測靈敏度高，能在模板DNA純度很低的情況下進行PCR擴增，減少培養介質和生物學物質的影響。該方法檢測時間僅需8～10 min；結果肉眼可見且判定標準統一，僅需一臺便攜PCR儀和相關試劑即可完成田間檢測或流動檢測，也極大簡化了核酸水平檢測的實驗環境與實驗環節的需求。但同時又可檢出此前蛋白試紙等快速檢測法無法覆蓋的轉基因元件檢測及事件特異性檢測，可檢出非表達的轉入基因、啟動子及終止子元件等。此外由于該技術實現了快速可視化的PCR結果讀取，避開凝膠電泳中EB等污染物，對操作者和試驗環境都是安全無害的。因而該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢測時間短、安全性高等顯著優勢，在轉基因玉米、水稻、大豆等作物中均具有較大應用前景，在轉基因新品種的培育中存在更大的應用前景和空間。

此外，該方法也可同時檢測雙基因樣品。若在同一反應體系中進行多重PCR，則可在引物設計時使用不同的探針(如TAMRA等)，并在試紙增加上包被相應檢測T線，從而實現雙基因檢測，以延展使用范圍。但在實驗過程中，也發現該方法還存在一些局限性。在一些使用常規PCR也無法檢驗的材料盲區，如對儲存條件不佳的種子或老葉片進行實驗時，由于實驗材料中的核酸已被破壞，因而即便是使用該方法也無法獲得更好的檢測結果。且該方法對于一些未存在檢測標準的新基因和新轉基因事件的檢測[24]，需重新設計引物并在專業實驗室中進行多次常規PCR實驗以調整并確認引物的有效性后方可使用層析法查驗結果，因而在直接用于批量化檢測前仍需一些預實驗以調整實驗條件達到滿意的實驗效果。此外，在本研究中，由于大豆及水稻轉基因材料收集不足，未進行更多物種的更多轉基因材料的實驗以驗證該方法的廣適性。由于該方法在轉基因檢測領域尚屬首次使用，為使其在轉基因作物檢測中獲得更廣泛的應用，后續仍需對該方法進行不斷的補充、改進和完善。