耐除草劑玉米G1105E-823C定性檢測方法

溫洪濤,楊洋,丁一佳,苑冉,張秀杰,張瑞英*

1.黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所， 哈爾濱 150086； 2.農業農村部科技發展中心， 北京 100122

玉米作為單位面積產量最高的糧食作物[1]，盡管近年來播種面積不再大幅增加，但仍是我國播種面積最大的作物。根據國際農業生物技術應用服務組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)統計，2018年全球轉基因作物種植面積已達1.917億hm2，其中轉基因玉米的種植面積約占30%[2]。我國許多企業和科研機構也正在研發新型轉基因玉米，隨著轉基因玉米新品系的不斷增多[3-4]，為保障對轉基因玉米的有效監管，亟需研發針對轉化體的檢測方法[5]。

轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C是由北京奧瑞金種業股份有限公司研發的新型耐除草劑玉米，2012年該公司申請了發明專利[6]。研發單位采用農桿菌轉化法，在保證氨基酸序列不變的前提下對G2-aroA基因進行人工優化改造，將改造過的耐草甘膦mG2-aroA基因轉入目標受體，經過多代篩選獲得對草甘膦除草劑具有抗性的轉基因玉米G1105E-823C轉化體，與轉入原始G2-aroA基因的品種相比，G1105E-823C玉米中G2-aroA蛋白的表達量明顯提高，并且對草甘膦的耐受性也顯著提高[6]。目前G1105E-823C玉米已完成生產性試驗，正在申請安全證書，在我國具有重要的產業化應用前景，但我國當前尚未發布專門針對耐除草劑玉米G1105E-823C及其衍生品種的轉化體特異性檢測方法?；诖?，本研究以耐除草劑玉米G1105E-823C的植物基因組與外源插入片段的連接區序列為靶標，對其分別進行普通PCR和實時熒光PCR，并優化相應的反應體系和反應條件，以期建立起精準高效的耐除草劑玉米G1105E-823C的轉化體特異性定性檢測方法，為我國的轉基因安全監管提供相關技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C及其受體材料由農業農村部科技發展中心提供；G1105E-823C的表達載體為pCAMBIA3300經過改造后獲得的pS3300載體，連接目標片段后形成pS3300-UMG2，表達框包含了UBI啟動子，polyA-T-NOS終止子和mG2-aroA基因，均由農業農村部轉基因安全管理辦公室提供。

5種作物轉基因混合樣品：①其他轉基因玉米混合樣品(3272、Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON87460、MON88017)；②轉基因大豆混合樣品(305423、356043、CV127、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2、MON89788)；③轉基因水稻混合樣品(科豐6號、科豐8號、克螟稻、M12、TT51)；④轉基因棉花混合樣品(MON1445、MON15985、MON531、MON88913、LLCOTTON25)；⑤轉基因油菜混合樣品(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2)。每種轉化體含量均為1%，均由本實驗室收集保存。

DNeasy Plant Mini Kit植物DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Easy Dilution購自日本TAKARA公司；GoTaq?Green Master Mix普通PCR試劑盒購自美國Promega公司；iTaqUniversal Probes Supermix實時熒光PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

H2O3-PRO金屬浴購自北京卡尤迪公司；VX-200旋渦混勻儀購自美國Labnet公司；5424R臺式離心機購自德國Eppendorf公司；Nanodrop ND-2000核酸定量儀、MiniAmp普通PCR儀、QuantStudio 7實時熒光PCR儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 樣品DNA的提取參照DNeasy Plant Mini Kit植物DNA提取試劑盒說明書。

1.3.2引物及探針 本研究選用了前期根據奧瑞金公司提供的G1105E-823C玉米外源載體插入片段的側翼序列信息設計并篩選出的普通PCR和實時熒光PCR引物，探針5′端用6-羧基熒光素(FAM)標記，3′端用黑洞猝滅基團(BHQ1)標記，引物序列和所使用的熒光標記見表1。引物和探針均由Thermo Fisher Scientific公司合成，用雙蒸水將引物稀釋至10 μmol·L-1作為工作液備用。

表1 研究所用引物和探針信息Table 1 Primers and probes used in this study

1.3.3反應體系和反應條件的優化方法 普通PCR檢測方法中，對引物終濃度和退火溫度進行優化。反應總體系為25 μL，其中GoTaq?Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物終濃度分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1，DNA模板50 ng，用雙蒸水將總體積補齊至25 μL。選取的優化反應程序為：94 ℃預變性5 min ；94 ℃變性30 s，分別于56、58、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃總延伸7 min；10 ℃保存。PCR擴增反應結束后，取6 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并比較結果。

實時熒光PCR檢測方法中，對引物和探針的濃度進行優化?？傮w系為20 μL，其中iTaqUniversal Probes Supermix 10 μL，上下游引物終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1，探針終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1(將4種引物終濃度和4種探針終濃度進行正交形成16個濃度組合,具體見表2)，DNA模板50 ng，用雙蒸水將總體積補足至20 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共40個循環；在第二階段的退火延伸(60 ℃)時段收集熒光信號，反應結束后分析并比較實時熒光PCR擴增效果。

表2 引物和探針濃度組合Table 2 The combination of different concentrations of primers and probes

1.3.4特異性測試方法 制備質量分數為1%的轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C粉末作為測試樣品，以其他轉基因玉米混合樣品、轉基因大豆混合樣品、轉基因水稻混合樣品、轉基因棉花混合樣品及轉基因油菜混合樣品作為比對樣品(質量分數均為1%)，并設置空白對照(水)，對1.3.3建立的轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR方法進行特異性測試。提取測試樣品和比對樣品的DNA，并按照1.3.3中優化后的方法進行普通PCR和實時熒光PCR，反應結束后分析上述2種定性檢測方法是否具有良好的特異性。

1.3.5靈敏度測試方法 普通PCR檢測方法中，對G1105E-823C轉化體質量分數分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的5個樣品進行靈敏度測試；實時熒光PCR檢測方法中，對G1105E-823C轉化體質量分數分別為100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.05%和0.025%的7個樣品進行靈敏度測試。按照1.3.3中優化后的方法分別進行普通PCR擴增和實時熒光PCR擴增，設置空白對照，每個濃度重復3次，反應結束后，分析靈敏度測試結果。

1.3.6檢出限測試方法 制備G1105E-823C轉化體質量分數分別為0.1%和0.05%的樣品，并提取其DNA。隨機抽取60份G1105E-823C轉化體質量分數為0.1%的樣品進行普通PCR檢測方法的檢出限測試；隨機抽取60份G1105E-823C轉化體質量分數為0.05%的樣品進行實時熒光PCR方法的檢出限測試。按照1.3.3中優化后的方法分別進行普通PCR擴增和實時熒光PCR擴增，反應結束后，分析檢出限測試結果。

2 結果與分析

2.1 反應體系和反應條件的優化

為獲得最優擴增效果，對2種定性檢測方法進行了反應體系和反應條件的優化。普通PCR檢測方法中，共設置了3種退火溫度(56、58、60 ℃)和5種引物終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)以進行最優反應體系和反應條件測試。結果(圖1)表明，在3種溫度下該引物的擴增效率基本相同，沒有出現典型的非特異性條帶；在引物終濃度為0.4和0.5 μmol·L-1時擴增效率較高，且條帶亮度基本一致。根據其擴增效率并為與內標基因zSSⅡb引物的反應條件相適應，確定退火溫度為58 ℃，反應體系中的引物終濃度為0.4 μmol·L-1。

注: M—DNA marker。圖1 普通PCR方法反應體系和反應條件的優化Fig.1 Optimization for reaction system and conditions of general PCR

實時熒光PCR檢測方法中，共設置了4種引物終濃度和4種探針終濃度，引物和探針共形成16個濃度組合(表2)。實時熒光PCR擴增結果(圖2)顯示，引物濃度在0.4 μmol·L-1以上、探針濃度在0.4 μmol·L-1以上時，Ct值差異并不明顯。最后綜合考量了平臺期信號強度和體系配置等因素，確定標準檢測體系中的引物終濃度為0.4 μmol·L-1，探針終濃度為0.4 μmol·L-1。

圖2 實時熒光PCR反應引物濃度優化Fig.2 Optimization for primer concentration of real-time PCR

2.2 特異性測試

為測試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測方法的特異性，以5種轉基因作物(玉米、大豆、水稻、棉花、油菜)混合樣品(質量分數均為1%)作為比對樣品，質量分數為1%的耐除草劑玉米G1105E-823C作為測試樣品，按照優化后的方法對其分別進行普通PCR和實時熒光PCR擴增。檢測結果(圖3、4)表明，僅從G1105E-823C轉基因玉米樣品獲得了預期的目的片段(203 bp)和擴增曲線，而在其他樣品中均未獲得預期大小的條帶和擴增曲線。表明建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測方法具有高度特異性。

注：M—DL2000 marker；1—空白對照；2—1% G1105E-823C；3—其他轉基因玉米混合樣；4—轉基因水稻混合樣；5—轉基因大豆混合樣；6—轉基因棉花混合樣；7—轉基因油菜混合樣。圖3 轉基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的特異性測試Fig.3 Specificity test for general PCR of GM maize G1105E-823C

圖4 轉基因玉米G1105E-823C實時熒光PCR方法的特異性測試Fig.4 Specificity test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

2.3 靈敏度測試

為測試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測方法的靈敏度，普通PCR檢測方法中共設置5個G1105E-823C轉化體質量分數(1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%)依次遞減的樣品進行測試。結果(圖5)顯示，在質量分數為0.1%及高于0.1%的樣品中均能擴增到預期DNA片段，重復性良好。說明普通PCR檢測方法的靈敏度可穩定達到0.1%。

實時熒光PCR檢測方法中，共設置7個G1105E-823C轉化體質量分數(100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.05%和0.025%)依次遞減的樣品進行測試。結果(圖6)顯示，質量分數為0.05%及以上的樣品中均能獲得預期擴增曲線，重復性良好。說明實時熒光PCR檢測方法的靈敏度可穩定達到0.05%。

圖6 轉基因玉米G1105E-823C實時熒光PCR方法的靈敏度測試Fig.6 Sensitivity test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

2.4 檢出限測試

為測試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測方法的檢出限，普通PCR方法中，隨機抽取60份G1105E-823C轉化體質量分數為0.1%的樣品進行檢出限測試。結果(圖7)顯示，60次反應全部擴出目的條帶，可以確定普通PCR方法的檢出限為0.1%。

注：M—DL2000 marker；1—空白對照；2—非轉基因玉米；3～7—1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01% G1105E-823C。圖5 轉基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的靈敏度測試Fig.5 Sensitivity test for general PCR of GM maize G1105E-823C

實時熒光PCR方法中，隨機抽取60份G1105E-823C轉化體質量分數為0.05%的樣品進行檢出限測試。結果(圖8)顯示，60次反應全部出現典型擴增曲線，平均Ct值為35.63，可以確定實時熒光PCR方法的檢出限為0.05%。

圖8 轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C實時熒光PCR方法的檢出限測試Fig.8 Detection limit test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

3 討論

未發放生物安全證書的轉基因作物如果通過非法渠道被釋放進環境，可能會給周圍生物帶來很大的威脅，有鑒于此，我國也一直在加強針對新型轉基因作物的安全管理[7]，因而研發精準的轉基因作物身份鑒定技術具有重要的現實意義。當前，針對轉基因產品雖然有大量文獻報道了各種類型的檢測方法，如傳感器、微流控芯片、等溫擴增等[8-10]，但其中最可靠并且適用性最廣的仍然是基于PCR的方法[11-13]，并且在PCR檢測中以轉化體特異性序列為目標的方法特異性最高、效果最好[14-15]。

轉化體特異性PCR檢測方法是以轉基因作物中外源插入序列與受體作物基因組連接區作為檢測對象，其具有高度的特異性，目前已逐步成為國內外公認的轉基因產品檢測的首選方法[16-17]。本研究以耐除草劑玉米G1105E-823C的植物基因組與外源插入片段連接區序列為靶標，通過優化PCR反應體系，測試特異性、靈敏度和檢出限，分別建立了基于普通PCR和實時熒光PCR的G1105E-823C轉化體特異性的2種定性檢測方法，2種方法均能特異地檢測樣品中是否含有轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C成分，其中普通PCR檢測方法檢出限為0.1%，實時熒光PCR方法檢出限為0.05%。轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C定性檢測方法的建立，將對該轉化體的轉基因生物安全監管和知識產權保護提供重要的技術支撐。

注：M—DL2000 marker；1—空白對照；2—非轉基因玉米；3～62—0.1% G1105E-823C。圖7 轉基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的檢出限測試Fig.7 Detection limit test for general PCR of GM maize G1105E-823C

普通PCR方法具有成本較低、應用便利和普及性高等優點，而實時熒光PCR方法的靈敏度更高且對實驗室污染少[18]，在應用中不同使用者可根據實際情況在2種方法中靈活選擇，這將使檢測工作更加便利和高效。與定性檢測方法相比，定量檢測方法在檢測出轉基因成分的同時可以檢測出所含轉基因成分的含量[19]，并且實時熒光PCR引物探針也可以用在數字PCR的檢測體系中[20]，因此，本團隊將繼續研發基于實時熒光和數字PCR的轉基因耐除草劑玉米G1105E-823C定量檢測方法，以期為我國轉基因作物的科學監管提供更有力的技術支撐。