普通牛及其近緣種特異性序列篩選及環介導等溫擴增檢測方法

瞿展,賈犇,楊立桃

上海交通大學生命科學技術學院, 上海 200240

目前，市場上肉制品往往良莠不齊，“摻假肉”事件頻頻曝光，如2011年的“牛肉膏”事件(一種名為牛肉膏的添加劑可以讓低價豬肉變為高價“牛肉”)，不僅損害了消費者的利益，也帶來了食品安全風險[1-2]。牛肉是除豬肉外在我國肉類消費中占比較大的品種。由于牛肉具有比豬肉蛋白質含量高、脂肪含量低等優點，同時受到國外以牛肉為主的肉類飲食習慣的影響，牛肉越來越被消費者所青睞，人均消費量逐漸上升，牛肉進出口量也呈現增長趨勢[3]。因此，建立快速、可靠的肉制品中牛源性成分的檢測方法，對于保障肉制品成分真實性和食品安全具有重要意義。

隨著分子生物學技術的快速發展，食品中動物源性成分的檢測方法不斷被建立，并被應用于食品安全檢測。目前，食品中動物源性成分的檢測方法主要基于蛋白質和核酸2個水平。蛋白質水平的檢測方法包括基礎電泳分析法、免疫分析法、色譜分析法等；核酸水平的檢測方法包括常規PCR[4-5]、實時熒光定量PCR[6-7]、數字PCR[8-10]、隨機擴增多態性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)[11]和限制性內切酶片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)[12]等。然而，肉制品上市前一般都會經過一些特殊的物理或化學處理，肉制品中的蛋白質高級結構已發生變化，導致基于蛋白質水平的檢測方法適用范圍窄、可靠性低且檢測靈敏度不高，無法滿足相應的檢測要求。由于DNA具有高度保守性和熱穩定性，在肉制品加工過程中不易遭到破壞，且DNA可以在體外進行穩定富集、擴增和識別，故基于DNA的檢測方法具有特異性好、靈敏度高、成本低等優勢，已成為動物源性成分鑒定中最常用的方法。如基于豬線粒體控制區(D-loop區)序列，建立了豬肉成分的PCR檢測方法[13]；基于羊的環磷鳥苷磷酸二酯酶基因序列，建立了羊肉成分的熒光定量實時PCR檢測方法[14]；基于中國家鵝的單拷貝核基因序列，建立了鵝源性成分的數字PCR檢測方法[15]。

但由于常規PCR、實時熒光定量PCR和數字PCR等方法的試劑和儀器成本較高，難以進行現場的快速檢測。由日本學者Notomi等[16]研發的環介導等溫核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術，針對目的基因的6個區域設計4條引物，提高了檢測特異性。LAMP擴增產物為大小不同的莖環狀DNA片段混合物，可以通過常規的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，出現典型的梯型條帶即為陽性擴增；也可在產物中加入熒光染料SYBR GreenⅠ，直接肉眼觀察顏色是否由橙色變為綠色，以此判斷反應結果，無需昂貴的試劑和專業設備[17]。LAMP技術具有擴增產物多、時間短、反應恒溫以及成本低等優點。目前，在肉制品成分檢測領域，已經建立了豬[18-19]、馬[20]、雞[21]、鴨[21]、狐貍[22]等成分的LAMP檢測方法?；诖?，本研究以普通牛及其近緣種為研究對象，利用普通牛及其近緣種的保守性DNA序列設計LAMP擴增特異性引物，建立肉制品中普通牛及其近緣種成分的特異性檢測方法，以期快速、靈敏地篩查肉制品中普通牛及其近緣種成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用普通牛及其近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)樣品及其他動物樣品均由上海市出入境檢驗檢疫局提供。特異性鑒定中所用的植物樣品由本實驗室保存。實際檢測樣品均購自上海沃爾瑪超市。

實驗所用的MgSO4、ThermoPol Buffer和Bst酶購自美國NEB公司；dNTP購自日本Takara公司；甜菜堿購自美國Sigma公司；熒光染料SYBR Green Ⅰ購自美國Invitrogen公司；基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)購自北京天根公司；LAMP引物均由美國Invitrogen公司合成。

1.2 實驗儀器

Nanodrop 1000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；ABI Veriti 96Well PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)；DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學儀器有限公司)；UVP Biodoc-It 220凝膠成像一體機(上海天能科技有限公司)。

1.3 DNA提取與質量評估

對樣品進行預處理，將肉制品樣品攪碎成肉糜，將植物樣品研磨成粉末狀。隨后按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取樣品基因組DNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度計測定提取的DNA純度和濃度，并置于4 ℃保存。為符合進一步的檢測要求，DNA濃度為20 ng·μL-1，A260/A280為1.8～1.9，A260/A230>2.0。

1.4 引物序列設計

從NCBI基因庫中下載不同牛種(普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛)的基因組序列，將其拆分為相鄰間隔小于100 bp的小片段。通過Bowtie 2軟件，與其他物種的基因組序列比對，提取不同牛種中共有的小片段并連接相鄰片段，輸出Blast比對相似性大于99%且大于300 bp的牛近緣種共有區域，得到單拷貝的牛近緣種的特異性基因組DNA序列(GenBank序列號：DAAA02021529.1)，其位于奶牛7號染色體上，在4個不同牛種中同源性達到100%。在此基礎上設計LAMP引物，外引物包括上游外部引物(forward outer primer，F3)和下游外部引物(backward outer primer，B3)，內引物包括上游內部引物(forward inner primer，FIP)和下游內部引物(backward inner primer，BIP)。具體引物序列見表1。

表1 普通牛近緣種特異性序列的LAMP引物Table 1 Primers of specific sequence of bovine-related species

1.5 LAMP反應體系和反應條件優化

為了建立適用于檢測普通牛及其近緣種成分的LAMP方法，對LAMP反應體系的各個參數(鎂離子濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度、Bst酶濃度、引物比)和反應溫度進行優化。反應體系的各參數水平設置為：鎂離子濃度分別為1、2、3、4、5 mmol·L-1；dNTP濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1；甜菜堿濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol·L-1；Bst酶加入量分別為3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 U；外、內引物比分別為1∶2、1∶4、1∶8。采用不同水平的反應體系，于65 ℃恒溫擴增1 h，80 ℃ 10 min。反應結束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察是否出現LAMP產物典型的梯形條帶[16]。然后采用最優反應體系進行LAMP擴增，分別于60、61、62、63、64、65 ℃恒溫擴增1 h，80 ℃ 10 min。反應結束后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 LAMP特異性分析

分別以肉制品中常見的動物物種和植物物種的基因組DNA為模板，對建立的LAMP方法進行特異性分析。模板分別為：普通牛及其3種近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)樣品；11種其他動物(豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝)樣品；7種植物(水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽)樣品。采用優化后的LAMP反應體系，于65 ℃恒溫擴增1 h，80 ℃ 10 min。反應結束后加入1 μL的1 000×SYBR GreenⅠ染料，觀察顏色變化，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察有無典型梯形條帶。

1.7 LAMP靈敏度分析

以普通牛及其3種近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)為模板對建立的LAMP方法靈敏度進行評價。將每個物種的基因組DNA模板梯度稀釋，稀釋為6個不同濃度：20.000、10.000、2.000、0.200、0.020和0.002 ng·μL-1。以稀釋后的DNA溶液為LAMP擴增模板，采用優化后的LAMP反應體系，于65 ℃恒溫擴增1 h，80 ℃ 10 min，每個反應重復3次。反應結束后加入1 μL的1 000×SYBR GreenⅠ染料，觀察顏色變化，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察有無典型梯形條帶。

1.8 實際樣品檢測

為了驗證建立的LAMP方法在實際應用中的有效性，利用建立的LAMP方法對含有牛、羊、豬、雞、鴨等不同成分的市售肉制品進行檢測。檢測的市售肉制品共16種：惠宜香辣味牛肉干、海霸王撒尿牛肉丸、億百味牛肉粒五香味、惠之園精制牛肉卷、笑喔喔沙爹味牛肉干、雨潤牛肉風味肉排、惠之園精制羊肉卷、穆林農場羔羊卷、清牧鮮羊肉卷、惠宜原味豬肉松、金鑼優級王中王、休閑列車香辣味手撕肉干、定海針原味雞塊、雙匯雞肉火腿腸、來伊份鴨脖、無窮醬鹵鴨小腿。陽性對照模板為牦牛DNA。以不同的肉制品樣品為模板，采用優化后的LAMP反應體系，65 ℃恒溫擴增 1 h，80 ℃ 10 min。反應結束后，通過加入SYBR GreenⅠ染料觀察顏色變化和瓊脂糖凝膠電泳進行結果檢測。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系和反應條件優化

為了建立最優的LAMP反應體系，對LAMP反應體系的各個參數(鎂離子濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度、Bst酶濃度、引物比)和反應溫度進行了優化，擴增產物電泳結果如圖1所示。以鎂離子濃度為例(圖1A)，其中泳道4的條帶亮度最強，且呈典型的梯型條帶，因此體系中最優鎂離子濃度為該泳道對應的4 mmol·L-1鎂離子濃度。同理，最優dNTP濃度為0.2 mmol·L-1，最優甜菜堿濃度為0.7 mol·L-1，最優Bst酶加入量為8 U，最優外內引物比為1∶8，最優反應溫度為65 ℃。最終優化后LAMP體系為：10 μmol·L-1外引物F3和B3各0.25 μL，10 μmol·L-1內引物FIP和BIP各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2.5 μL，25 mmol·L-1MgSO44 μL，5 mol·L-1甜菜堿3.5 μL，8.0 U·μL-1Bst DNA聚合酶1 μL，10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，DNA模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。LAMP反應條件為：65 ℃恒溫擴增 1 h，80 ℃ 10 min。

2.2 LAMP特異性分析

為了驗證建立的LAMP方法的特異性，以不同的動植物樣品為模板進行特異性分析。以普通牛及其近緣種和其他動植物樣品為模板，采用已優化的LAMP體系進行擴增。結果顯示：在普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛樣品中擴增獲得階梯型條帶，反應顏色從橙色變為綠色；在豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝、水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽樣品中無擴增條帶，反應顏色為橙色(圖2)。特異性測試結果表明建立的LAMP方法可以特異性地檢測普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛。

A：鎂離子濃度優化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—1、2、3、4、5 mmol·L-1 Mg2+，6—空白對照；B：dNTP濃度優化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1 dNTP，6—空白對照；C：甜菜堿濃度優化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol·L-1 Betaine，6—空白對照；D：Bst酶濃度優化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—3.2、4.8、6.4、8、9.6 U·μL-1 Bst酶，6—空白對照；E：外內引物比優化，M—DL 2000 DNA Marker，1、2—1∶2，3、4—1∶4，5、6—1∶8，7—空白對照；F：反應溫度優化，M—DL 2000 DNA Marker，1～6—60、61、62、63、64、65 ℃；7—空白對照。圖1 LAMP反應體系和反應溫度優化Fig.1 Optimization of LAMP reaction system and reaction temperature

A：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，B：SYBR GreenⅠ染料可視化結果；M—DL 2000 DNA Marker；1～23—普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛、豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝、水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽、空白對照。圖2 LAMP特異性分析Fig.2 Analysis of LAMP specificity

2.3 LAMP靈敏度分析

為了鑒定建立的LAMP方法的靈敏度，以梯度稀釋的普通牛及其近緣種DNA為模板，采用優化好的LAMP體系，進行靈敏度分析。靈敏度結果顯示(圖3)：以普通牛的梯度稀釋DNA為模板的擴增反應中，在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴增和綠色的顏色反應，在0.002 ng·μL-1樣本中無擴增和顏色變化；以牦牛的梯度稀釋DNA為模板的擴增反應中，在20.000～0.200 ng·μL-1為模板的樣本中，具有典型的階梯型條帶擴增和綠色的顏色反應，在0.020和0.002 ng·μL-1L樣本中無擴增和顏色變化；以水牛的梯度稀釋DNA為模板的擴增反應中，在20.000～0.200 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴增和綠色的顏色反應，在0.020和0.002 ng·μL-1樣本中無擴增和顏色變化；以美洲野牛的梯度稀釋DNA為模板的擴增反應中，在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴增和綠色的顏色反應，在0.002 ng·μL-1樣本中無擴增和顏色變化。綜合普通牛及其近緣種梯度稀釋DNA樣品的檢測結果，表明建立的LAMP檢測方法的靈敏為0.020 ng·μL-1。

注：左列：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，右列：SYBR GreenⅠ染料可視化結果；M—DL2000 DNA Marker；1～6—20.000、10.000、2.000、0.200、0.020、0.002 ng·μL-1；7—空白對照。圖3 LAMP靈敏度分析Fig.3 Sensitivity of LAMP method

2.4 實際樣品檢測

為了驗證本研究建立的LAMP方法的實際應用效果，以含有牛、羊、豬、雞、鴨等不同成分的市售肉制品為模板，進行LAMP擴增。結果顯示：在6個含有牛肉成分的樣品中擴增獲得階梯型條帶，反應顏色從橙色變為綠色；在不含牛肉成分的其余10個樣品中無擴增條帶，反應顏色為橙色(圖4)。實際樣品檢測結果表明建立的LAMP方法可以用于市售肉及其制品中牛肉成分的檢測。

A：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，B：SYBR GreenⅠ染料可視化結果；M—DL2000 DNA marker；1～18—惠宜香辣味牛肉干、海霸王撒尿牛肉丸、億百味牛肉粒五香味、惠之園精制牛肉卷、笑喔喔沙爹味牛肉干、雨潤牛肉風味肉排、惠之園精制羊肉卷、穆林農場羔羊卷、清牧鮮羊肉卷、惠宜原味豬肉松、金鑼優級王中王、休閑列車香辣味手撕肉干、定海針原味雞塊、雙匯雞肉火腿腸、來伊份鴨脖、無窮醬鹵鴨小腿、陽性對照(牦牛)、空白對照。圖4 LAMP方法的實際樣品檢測Fig.4 Detection of practical sample by LAMP method

3 討論

牛肉作為我國第二大的肉類食品，常常涉及到肉制品摻假事件，嚴重損害了消費者權益。故本研究建立快速、可靠的牛源性成分檢測方法，以驗證在聲稱含有牛源性成分的肉制品中其成分的真實性。以食用為目的的牛肉中，普通牛、牦牛、水牛較為常見，而在NCBI基因庫中可以獲得普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛完整的全基因組序列，因此本研究以這4種牛近緣種為研究對象。由于算法是在4個牛近緣種的全基因組序列的基礎上建立的，因此最終得到的牛近緣種基因組靶標基因序列具有高特異性。本研究建立的方法能夠同時檢測普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛不同的牛源性成分，在肉制品牛源性成分檢測中具有很高的適用性。

目前，關于動物源性成分的LAMP檢測方法大多是針對單靶標進行檢測的，而且大部分方法是基于線粒體DNA靶序列的。如根據狐貍線粒體DNACoxⅠ基因序列建立了一種能夠快速區分出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的LAMP檢測方法[22]；根據牛線粒體cytB基因設計特異性引物，通過動物Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統，建立了牛源性成分的LAMP檢測方法[23]，但此類方法線粒體的拷貝數高且不恒定，可能出現假陽性問題。因此，本研究是基于特異性單拷貝的基因組DNA靶序列來進行檢測，有效降低了假陽性率，在實際檢測中具有更高的可操作性。而且本研究中的候選序列是通過對不同牛種的全基因組序列進行掃描而得，所用生物信息學算法確保了靶序列的準確性，所以與其他已報道的牛源性成分檢測方法相比更加可靠、準確。

本研究建立的LAMP方法能在1 h內特異地檢測出普通牛、牦牛、水牛及美洲野牛成分，檢測靈敏度達到0.020 ng·μL-1，可應用于肉制品中對牛近緣種成分的實際檢測。檢測結果可通過凝膠電泳圖觀察得到，或者在擴增產物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料后直接用肉眼觀察。綜上，本研究所建立的LAMP方法具有高特異性、高靈敏度、反應快速、操作簡便和無需精密儀器等特點，可應用于肉制品中牛及其近緣種成分的實際檢測，為我國肉類食品的安全監管和肉類的出入境檢驗檢疫提供有效的技術保障和支持。但同時，此方法也存在一些不足。LAMP擴增結束后，可通過凝膠上的梯度條帶或產物反應顯色得到檢測結果，導致此方法難以同時進行多靶標檢測。目前關于多靶標復合檢測已有一些相關報道[24]，但由于多套引物之間可能存在相互抑制作用，LAMP多重檢測仍存在難度。未來，本方法還可以進一步和DNA快速提取裝置、橫向流動試紙條、微流控芯片等其他裝置相結合，建立更成熟的多靶標復合核酸檢測方法，從而實現高通量的LAMP現場快速檢測，為我國的食品安全監管提供更加有效的技術方法。