薔薇科果樹組織培養研究進展

吳靜妍 葛新新 李海英

摘要 薔薇科果樹種類繁多，是果品生產中的極佳選擇。組織培養技術有利于果樹的種苗繁育、培育新品種及縮短育種時間，從而成為薔薇科果樹快速繁育的有效途徑。從影響組織培養成敗的幾個重要因素（外植體的取材部位及時期、滅菌時間的控制、培養基及植物激素的選擇），歸納了薔薇科果樹組織培養技術的研究進展，以期為薔薇科果樹的組培快繁體系建立提供參考。

關鍵詞 薔薇科果樹;組織培養;研究進展

中圖分類號 S628 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0010-03

Abstract There are many varieties of Rosaceae fruit trees， which is an excellent choice for fruit production.Tissue culture technology is conducive to breeding fruit trees seedlings，cultivating new varieties and shortening the breeding time， thus becoming an effective way for the rapid propagation of Rosaceae fruit trees.This paper summarized the research progress of tissue culture techniques of Rosaceae fruit trees from several important factors affecting the success of tissue culture （the location and period of explants， the control of sterilization time， the selection of culture medium and plant hormones），in order to provide reference for the establishment of tissue culture and rapid propagation system of Rosaceae fruit trees.

Key words Rosaceae fruit trees;Tissue culture;Research progress

作者簡介 吳靜妍（1991—） ，女，吉林公主嶺人，研究實習員，碩士，從事觀賞果樹育種研究。*通信作者，助理研究員，碩士，從事觀賞果樹栽培技術研究。

收稿日期 2020-04-28;修回日期 2020-06-18

薔薇科果樹種類繁多、適應性強，是果品生產中的極佳選擇。隨著市場需求的加大，加快選育品質優良的果樹品種及提高種苗繁育效率成為當務之急。傳統的果樹育種方法包括引種、實生選種、雜交育種、輻射誘變和芽變等，但果樹的生長周期長、雜合度高、自交不親和等問題，傳統的育種方法存在一定局限性。

植物組織培養是一種無性繁殖方式，是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、胚胎、細胞及原生質體在人工配制的培養基上給予一定的條件進行培養，使其潛伏芽萌發或誘導愈傷組織形成，最終獲得完整植株[1]。利用植物組織培養技術，可生產大量的優良無性系，有利于果樹種苗繁育;還可以通過細胞融合克服遠緣不親和性障礙，有利于果樹新品種的培育;另外，還可獲得單倍體、二倍體、純合二倍體和其他多倍體，有利于縮短育種時間[2-4]。近年來，國內外已有一些果樹組織培養相關的研究報道[5-10]，但缺乏系統的比較和總結。筆者從影響組織培養成敗的幾個重要因素（外植體的取材部位及時期、滅菌時間的控制、培養基及植物激素的選擇）歸納了近年來薔薇科常見果樹組織培養技術的研究進展，以期為薔薇科果樹的組培快繁體系建立提供參考。

1 外植體

在植物組織培養中，離體培養的材料器官或組織片段稱作外植體。幼芽、莖段是適合愈傷組織誘導的外植體材料。秦偉[11]研究了新疆蘋果以不同器官為外植體的愈傷組織誘導率，其幼莖的誘導率高于葉、子葉，而誘導根則無愈傷組織形成。韓沙沙等[12]分別以油桃無菌苗的莖段、去皮莖段、幼芽及葉片進行愈傷組織誘導，差異顯著，幼芽、莖段、去皮莖段的誘導率分別為65.8%、59.2%、50.0%，而葉片誘導率僅為27.5%。同時，莖段也是適合誘導潛伏芽萌發的外植體材料，王婷婷等[13]以蘋果接穗品種SVM-O5扦插苗木莖段為外植體，建立其組織培養體系。

組織培養的成功也受外植體取材時間的影響，取材時間過早，芽體剛開始萌動，接種后生長緩慢，取材時間過晚，內部營養積累少且帶菌多，不利于滅菌處理且成活率低。對紅花山楂莖段的誘導培養中發現，3月份取材為好，而6月份取材所接種的外植體全部污染[14]。對于杏扁品種“優一”，5月份為最佳取材時間，3月份取材接種后生長緩慢，8—10月份取材的外植體會出現嚴重褐化[15]。另外，外植體的長度也是影響成活率的一個因素，山楂品種“蒙山紅”以莖段為外植體時，其長度以1.2～1.5 cm為宜[16]。

2 滅菌

植物組織培養要求嚴格的無菌條件，行之有效的滅菌方法有利于試管苗避免污染。針對外植體生長程度、表面帶菌種類和內生菌等不同情況，滅菌時應選擇合適的消毒液種類。常用的滅菌劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、升汞、抗生素和硝酸銀等，其中升汞被認為是目前消毒效果最好的。方慶等[17]以桃莖段為外植體，比較75%乙醇、升汞、次氯酸鈉3種滅菌試劑的效果，結果發現用75%乙醇浸泡后，再用升汞處理的效果好于次氯酸鈉，0.15%升汞滅菌9 ?min效果最好。但是，升汞是一種劇毒試劑，滅菌的同時對植物材料也有很強的傷害作用，控制合適的滅菌時間極為重要，一般升汞消毒時間在4～9 min為宜。劉小芳等[18]以“庫爾勒香梨”為試驗材料研究0.1%升汞的浸泡滅菌時間，結果發現滅菌5 min時成活率達90%。江珊等[19]進行了0.1%升汞滅菌處理時間梯度試驗，以桃“保佳俊”外植體為材料，結果表明，升汞滅菌9 min為最佳時間。馮莎莎等[15]研究發現杏扁品種“優一”的升汞滅菌最佳處理時間為8 min，污染率低且萌芽率最高。吳高殷等[20]以山杏莖尖和當年生莖段為材料，使用75%乙醇處理30 s，0.2% 升汞滅菌 6 ?min，再用2%NaClO 處理4 ?min，進行滅菌，其誘導效果最佳?？拙S龍等[16]以山楂新品種“蒙山紅”莖段為外植體，經乙醇處理30 s、升汞處理4 min時成活率達100%，污染率為0。

賈海燕等[21]在對歐李外植體消毒時，在乙醇和升汞的處理中加入超聲，超聲的空化作用使清洗和消毒更加徹底，可有效降低污染率，依此建立了“歐李快繁體系”。但是升汞的劇毒性質，不利于試驗操作和廢液處理。Araba等[22]對于G×N15（杏仁×桃）雜交種的研究表明，NS（納米銀）浸泡或添加到培養基中均可減少內部、外部污染，且在培養基中添加NS的效果優于浸泡外植體。NS溶液可以用作G×N15微繁殖的低風險殺菌劑，未來可以作為升汞的合適替代品。

3 培養基

培養基是由不同營養物質配制而成的，可以給微生物、植物或動物的生長繁殖提供營養的基質。目前，在果樹組織培養中常用的培養基有MS、WPM、White、QL、B5等。MS培養基使用較為普遍，其成分中鉀、銨和硝酸鹽的含量均較高;相對于MS培養基，WPM培養基用硫酸鉀代替了硝酸鉀，硝酸銨的含量也變為MS培養基的1/4;White培養基中無機鹽數量較低;WPS培養基中鈣離子含量高，含有硝態氮，無銨態氮和碘化鉀;QL培養基組分的主要差異是NH4+含量和NO3-與NH4+比例的不同;B5培養基中銨含量較低，而銨對不少植物材料的生長都有抑制作用。

薔薇科果樹初代培養基多選用MS或改良MS培養基效果較好，如MS培養基為“金凱特”杏芽段、杏扁品種“優一”的外植體腋芽萌發的最佳培養基[15，23]。但不同樹種間存在一定差異，如以李品種“紅美麗”的莖段為外植體，QL培養基比MS培養基更利于腋芽萌發[24]。

繼代培養的培養基選擇以MS培養基、QL培養基、WPM培養基為主。MS適宜桃“保佳俊”組培苗的繼代培養及歐洲李“紅艷1號”莖段的增殖培養[19，25]。

但蘋果抗寒半矮化砧木“54-118”、矮化砧木“JM7”的試驗結果均表明，其試管苗雖然在MS培養基上增殖較好，但QL培養基更有利于獲得健壯生長的綠苗，適合蘋果砧木試管苗的繼代培養[26-27]。對于“金凱特”杏組織培養的研究發現

WPM培養基更適合其芽段增殖快繁及新梢生長[23]。孫浩元等[28]建立了李杏砧木“St.JulienA”的無性繁殖技術體系，發現WPM培養基對其外植體再生及芽增殖的影響好于其他類型的基本培養基。另外，桃豫農矮化砧木1號葉片愈傷組織的繼代培養需要添加1.0 mg/L 2，4-D的MS培養基與WPM培養基交替使用[29]。魏明杰等[30]分別用F14 培養基和MS培養基進行櫻桃莖尖培養，F14培養基處理條件下，其增殖系數更高。趙劍波等[31]以桃砧木GF677莖段為外植體，在基本培養基F14上添加不同激素進行正交試驗，確立了桃砧木GF677的離體繁殖體系。

生根培養基多考慮降低無機鹽濃度的MS培養基。1/2 MS培養基利于李杏砧木“St.JulienA”的生根培養[28]，1/4 MS培養基對于光葉山楂的生根培養效果良好[32]。生根培養基還可以通過分析植株器官、組織大量元素含量調配，魏鵬等[33]以“庫爾勒香梨”莖葉為試驗材料，按照Goncalves提出的調配方法調配生根培養基中大量元素含量，效果理想。

4 植物激素

基本培養基是保證外植體生存與生理活動的最基本物質，而細胞分裂的啟動、培養物的形態建成、芽的分化則離不開植物激素的誘導調節。試驗證明，當分裂素/生長素的比值較大時，有利于誘導芽的形成;當分裂素/生長素的比值較小時，則有利于根的形成[34]。

常用的細胞分裂素有CTK、KT、ZT、6-BA、BA、CPPU、TDZ等，生長素有IAA、NAA、IBA等。TDZ被認為是木本植物組織培養中活性最強的類細胞分裂素物質，4.5 μmol/L TDZ預培養可以增加供體枝條葉再生能力[35]。

薔薇科果樹莖尖、莖段、芽的培養中常添加的激素有6-BA、NAA、IBA。楊艷敏等[36]研究發現6-BA（1.5 mg/L或1.0 mg/L）可提高3個蘋果矮化品種外植體誘導率及促進試管苗增殖和生長。周春娜[37]研究發現在巴旦杏的初始誘導和繼代培養基中添加6-BA、NAA，效果良好;馮莎莎等[15]的試驗也證明了6-BA、NAA協同作用有利于杏扁品種“優一”的莖芽增殖。宋健坤等[38]認為梨砧木OH×F51莖尖離體培養的最佳培養基是MS+2.0 ?mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA，莖尖誘導成苗率最高。生根培養中，單獨使用低濃度的IBA（0.2 ?mg/L）時山杏生根率高[20]，而杏扁品種“優一”生根率隨著IBA濃度增加呈先增加后下降，0.4 mg/L為最適濃度[15]。方明等[39]研究了梨試管苗的兩步生根法，在1/2 MS+0.2 mg/L IBA 上暗培養7 d+光照培養7 d后，在IBA 0.2 mg/L中蘸根10 s（或15 s），再轉移至僅含有1/2 MS培養基中培養，4種梨試管苗的生根率在40%～90%。

愈傷組織誘導常添加的激素有6-BA、2，4-D 、NAA、TDZ。宋健坤等[38]研究發現，培養基NN69 +3.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA梨砧木OH×F51葉片的出愈率達98.33%。以油桃帶芽莖段為外植體，油桃愈傷組織的誘導率隨2，4-D濃度的升高而升高，NAA、BA影響不大[40]。以桃豫農矮化砧木1號的葉片為外植體，在0～2 mg/L時2，4-D濃度越高，愈傷組織的誘導率也隨之升高[29]。吳高殷等[20]研究了山杏莖尖愈傷組織的誘導，結果表明當6-BA與2，4-D 濃度低時誘導率高，但是后期出現褐化現象。另外，NAA可促進光葉山楂外植體的愈傷組織形成，CPPU 抑制其愈傷組織的形成但不抑制生長，同時也證明了CPPU是一種非常有效的細胞分裂素[32]。

5 其他因素

除以上主要因素與組織培養成功率有一定關系外，光照條件、氣態微環境也可產生影響。如黑暗條件能夠促進愈傷組織的形成，“滿園紅”油桃果肉在黑暗條件下誘導出的愈傷組織呈松散狀并生長良好[40]。崔美等[41]對以國光蘋果和富士蘋果的幼嫩葉片為外植體進行誘導培養，發現暗培養14 d最有利于愈傷組織的形成。沙梨種子接種在培養基上暗培養7 d能促進種子萌發，苗健壯，葉片黃綠[42]。柳金鳳等[43]研究了不同光質對紅花山楂試管苗生長的影響，結果表明紅藍光7∶9光質條件下，最有利于紅花山楂的分化、生根，且移栽后成活率最高。Cati等[44]、Marino等[45]研究杏組織培養中氣態微環境的影響，不同類型的密封影響杏芽積累的乙烯和二氧化碳含量，進而影響增殖及生根。

6 討論與展望

組織培養因其具有繁殖周期短、培養條件可以人為控制、可直接誘變和篩選出高抗優良品種等優點，已在苗木快繁、轉基因、培養脫毒苗、花藥培養、超低溫種質保存等方面廣泛應用。薔薇科果樹組織培養技術已發展多年并取得不少成就，但仍存在一些問題。污染、褐化、玻璃化等問題會直接影響組織培養的成敗。

因此，從外植體的選擇、消毒時間的控制以及培養基、植物激素的選擇，每一環節都至關重要。目前來看，果樹組織培養多以莖段、莖尖、葉片為外植體，今后可以加大外植體的選擇范圍，同時進一步探索升汞的合適替代品，使植物組織培養安全、無污染。在解決污染、褐化、玻璃化等問題時，如何降低成本也是需要考慮的因素，高成本不利于商業化生產的發展。

今后應繼續加大樹種、品種的研究范圍，為薔薇科果樹的育種和遺傳轉化打下堅實基礎，薔薇科果樹的經濟價值、生態價值及園林應用價值也得到更大程度的發揮。

安徽農業科學 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2020年

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