向日葵油酸合成上游基因HaFAB2克隆與表達分析

周 菲

（1.黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農業科學院經濟作物研究所，哈爾濱 150086）

向日葵（Helianthus annuusL.）是重要油料和經濟作物[1]。我國向日葵產區主要分布在東北、西北和華北，冷涼氣候條件下生產的葵花籽一般油酸含量相對較低，因此，提高向日葵種子油酸含量是我國向日葵遺傳改良重要目標。

植物脂肪酸合成代謝通路主要包含脂肪酸脫飽和酶（FAD）、乙酰CoA羧化酶（ACCase）及脂肪酸合酶復合體（FAS）等。近年來，關于脂肪酸含量相關酶基因研究越來越多。至今在大豆中已分離得到脂肪酸合成酶相關基因包括ACC、FatB、KASⅠ、KASⅡ、KASⅢ、SACPD等[2]。將大豆中GmACP基因沉默后，大豆根中總脂肪酸含量降低22%[3]。將高山被孢霉（Mortierella alpina）中Δ6脫飽和酶的同工酶基因Δ6II轉化到米曲菌（Aspergillus oryzae）中表達，導致γ-亞麻酸（GLA）占總脂肪酸37%，而在對照米曲菌（Aspergillus oryzae）中未檢測到γ-亞麻酸[4]。將玻璃苣種子中分離的Δ6-脂肪酸去飽和酶基因轉化到煙草中，對轉基因煙草葉片脂質分析表明，γ-亞麻酸（GLA）和十八碳四烯酸（C18∶4 Δ6,9,12,15）分別積累到總脂肪酸含量13.2%和9.6%[5]。將擬南芥中Δ15脂肪酸去飽和酶轉化到大豆，其α-亞麻酸（ALA）含量顯著升高，而同時具有玻璃苣中Δ6-脂肪酸去飽和酶和擬南芥中Δ15脂肪酸去飽和酶兩種去飽和酶的轉基因大豆，其十八碳四烯酸（STA）相對含量明顯提高，ω-3類脂肪酸相對含量達到60%以上[6]。在亞麻中通過體內體外試驗發現，LuLACS8A和LuDGAT2-3共表達催化亞麻酸在三酰甘油（TAG）中富集[7]。研究發現植物中轉錄因子對油脂和脂肪酸合成也具有重要調控作用，這些轉錄因子主要包括AP2家族WRI1、B3家族FUS3、DOF家族DOF、HAP3/CBP家族LEC1和CHD3家族PKL等，利用代謝調控網絡發揮調控脂肪酸功能[8]。

油酸（18∶1）第9位與第10位碳原子間含一個雙鍵因此成為單不飽和脂肪酸，第12位碳原子脫飽和后形成亞油酸（18∶2）[9]。目前向日葵與油酸含量相關基因研究較少，Δ12脂肪酸脫氫酶基因位于油酸合成通路下游，控制油酸轉化成亞油酸，是控制種子油酸含量關鍵基因[10]。油料作物如大豆、玉米、油菜、花生種子中，通過RNA干擾等技術抑制FAD2基因表達抑制油酸合成亞油酸，顯著提高種子油酸含量[11]。FAB2（Stearoyl-ACP Desaturase 2）編碼Δ9硬脂酰-ACP脫飽和酶，是植物體內調控油酸合成上游基因，在18碳脂肪酸長鏈第9和第10個碳原子之間插入一個雙鍵，使硬脂酰-ACP脫氫生成油酰ACP，油酰-ACP轉運至內質網后形成油酸，該過程直接影響油酸含量。FAB2在大部分高等植物不同組織部位中具有表達特異性，在發育種子中表達量最高[12]。FAB2是脂肪酸合成過程中飽和脂肪酸轉化成不飽和脂肪酸關鍵分支點，是不飽和脂肪酸合成中必不可少的重要酶，FAB2可能是除FAD2外控制油酸含量另一個關鍵基因[9]，此外，FAB2還參與植物膜脂質中不飽和脂肪酸生物合成，關系到細胞膜流動性與耐受性，具有抗非生物脅迫等重要功能[13]。但目前關于向日葵FAB2基因研究未見報道，其編碼蛋白結構、表達模式及功能尚不明確。

向日葵脂肪酸代謝關鍵酶基因克隆和表達模式分析是基因功能研究重要前提，可為向日葵脂肪酸合成分子機理解析提供科學依據。本課題組前期利用高低油酸向日葵種子轉錄組測序結果，在脂肪酸代謝通路差異表達基因中挖掘出可能影響油酸含量的候選基因硬脂酰-ACP脫氫酶基因HaFAB2，以此為基礎，本研究克隆向日葵Ha-FAB2基因，并作生物信息學分析，結合高低油酸向日葵種子中油酸積累變化趨勢，分析HaFAB2基因在不同發育時期種子及其他組織部位表達模式，為該基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”和低油酸保持系“86-1”于2019年種植于黑龍江省農業科學院經濟作物研究所試驗基地。于同一時段對當日開花植株掛牌，標明開花日期，從開花7 d起，每5 d取5個花盤，取至開花后37 d，取花盤最外3圈種子，一部分樣品風干后測定油酸含量；另一部分液氮速凍后凍存于-80℃冰箱，用于基因克隆和熒光定量PCR分析，基因克隆利用“86-1”開花7 d種子為試驗材料。

1.1.2 菌株與載體

克隆載體pMD18-T（TaKaRa），大腸桿菌DH5α感受態細胞（博凌科為）。

1.1.3 主要試劑

所用試劑包括DNA marker DL2000（東盛）、2×KOD PCR MasterMix（艾德萊）、2×Taq PCR Master-Mix（艾德萊）、gel-red染料（莫納）、氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒（天根）、無水乙醇、β巰基乙醇、50×TAE。

1.1.4 培養基配制

液體LB培養基：稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl，溶解于1 L水中。若配制固體LB培養基每升再加12 g瓊脂粉；IPTG溶液（24 mg·mL-1）：稱取0.24 g IPTG，溶解于10 mL去離子水，完全溶解后過濾并滅菌；X-Gal溶液（20 mg·mL-1）：稱取0.1 g X-Gal，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，最后加DMF定容至5 mL。

1.2 方法

1.2.1 種子RNA提取及cDNA第一條鏈合成

利用植物總RNA提取試劑盒（天根）提取向日葵種子總RNA，取0.5 μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第一條鏈。

1.2.2 HaFAB2基因克隆

根據已公布向日葵基因組數據庫信息，設計向日葵HaFAB2基因克隆引物，引物序列為F：AGAACAACATCAACAATGGCGATTC，R：AGCAC TACACGAAAGAAACGACAAT，使用高保真酶（艾德萊）擴增HaFAB2基因開放閱讀框（ORF）序列，PCR總反應體系20 μL：cDNA 1 μL，Primer各1 μL，2×KOD PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴增程序為：94℃3 min，94℃30s，58℃30 s，72℃90 s，共30個循環，最后72℃延伸7 min。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根）回收目的條帶，并克隆至pMD18-T載體（TaKaRa），挑取陽性克隆，經菌液PCR驗證送吉林省庫美生物有限公司測序。

1.2.3 基因生物信息學分析

利用DNAMAN比對克隆基因序列和NCBI公布向日葵基因序列。在NCBI BLAST數據庫中作序列同源性比對和相似性搜索。MEGA7軟件構建系統進化樹。利用ExPASy系統下蛋白質基本理化性質預測工具Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）預測氨基酸組成、相對分子質量、等電點和原子組成等參數。利用SOPMA在線程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白二級結構。利用Protscale在線軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析基因氨基酸序列親/疏水性。

1.2.4 種子油酸含量檢測

向日葵種子油酸含量委托中國農業科學院油料作物研究所測定，采用氣相色譜法，儀器為Agilent7890A氣相色譜儀。利用SPSS 13.0軟件分析種子發育不同時期油酸含量變化差異顯著性。

1.2.5 熒光定量PCR分析

采用 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內參基因，Real-time PCR總反應體系為20 μL：cDNA 1.2 μL， SYBR Green 10 μL， Primer 各 0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。Real-time PCR 反應程序如下：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68℃ 30 s，共45個循環，待PCR反應結束后分析溶解曲線，采用2-ΔΔCt法分析目標基因表達量。內參基因β-actin引物為F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaFAB2熒光定量引物為 F：CTGGTCAAACAGTCAACATATGGGT，R：CA GCGGTTATGGTGAGGT。利用SPSS 13.0軟件分析基因在“L-1-OL-1”和“86-1”種子中表達量差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 向日葵HaFAB2基因克隆

將提取的“86-1”開花7 d種子總RNA反轉錄合成cDNA，使用設計好的引物擴增HaFAB2開放閱讀框（ORF）序列，PCR結果顯示有符合目的片段長度的單一條帶（見圖1）。將膠回收后目的片段與T載體連接并轉化大腸桿菌，菌液PCR檢測結果表明擴增出陽性條帶符合目的片段長度，將菌液送至公司測序，比對結果表明序列正確。向日葵Ha-FAB2基因ORF核苷酸序列長度為1 191 bp，編碼396個氨基酸，通過比較克隆的HaFAB2和NCBI公布向日葵FAB2（LOC110878160）序列發現，核苷酸序列相似度為99.16%（見圖2）。

圖1 向日葵HaFAB2基因PCR電泳結果Fig.1 PCR electrophoresis result of sunflower HaFAB2 genes

圖2 克隆HaFAB2與公布向日葵FAB2核苷酸序列比對結果Fig.2 Comparison of nucleotide sequences of HaFAB2 cloned with FAB2 published in sunflower

2.2 HaFAB2基因生物信息學分析

2.2.1 向日葵HaFAB2編碼蛋白質基本理化性質預測

ExPASy軟件預測結果表明，HaFAB2基因編碼蛋白原子總數6 307個，分子式C2014H3131N551O594S17，蛋白分子質量45.11 ku，等電點理論值5.99，預測該蛋白為酸性蛋白，HaFAB2編碼蛋白質氨基酸組成見表1。

2.2.2 向日葵HaFAB2基因系統進化分析

為分析向日葵HaFAB2基因進化關系，將其與擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）、大豆（Glycine maxL.）、異果菊（Dimorphotheca sinuataDC.）、煙草（Nicotiana tabacumL.）和薇甘菊（Mikania micranthaKunth）等物種FAB2氨基酸序列作系統進化樹構建與分析（見圖3A）。

上述結果可知，向日葵HaFAB2與薇甘菊（Mikania micranthaKunth）FAB2聚在同一分支上，進化關系最近，序列相似性高達94%，可能是由于向日葵和薇甘菊同屬菊科，具有物種同源性。將NCBI上檢索到向日葵FAB家族3個成員HaFAB1（CAC80359.1）、HaFAB2（XP_021982111.1）、HaFAB3（KAF5783066.1）與擬南芥硬脂酰-ACP脫飽和酶（SAD）家族7個成員AtSSI2（At2g43710）、AtSAD1（At5g16240）、AtSAD2（At3g02610）、AtSAD3（At5g 16230）、AtSAD4（At3g02620）、AtSAD5（At3g02630）、AtSAD6（At1g43800）以及蓖麻RcSAD1（NP_00131 0659.1）作進化關系分析（見圖3B）。其中，AtSSI2和RcSAD1對18∶0-ACP具有底物選擇性，催化18∶0-ACP生成18∶1-ACP，結果發現HaFAB1、HaFAB2、HaFAB3序列相似性較高，并與擬南芥AtSSI2和蓖麻RcSAD1聚在同一個分支上，其中HaFAB2與AtSSI2、RcSAD1序列相似性分別高達80.55%和84.60%，表明親緣關系較近。

表1 向日葵HaFAB2編碼蛋白質氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

圖3 向日葵HaFAB2基因系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HaFAB2 gene in sunflower

2.2.3 蛋白質二級結構預測

通過使用SOPMA在線軟件預測分析HaFAB2編碼蛋白質二級結構，結果表明，該蛋白質具有53.54%α螺旋，33.84%無規則卷曲，7.58%延伸鏈，5.05%β轉角。預測結果表明，HaFAB2編碼蛋白二級結構為α螺旋（見圖4）。

圖4 向日葵HaFAB2編碼蛋白質二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

2.2.4 蛋白質親疏水性分析

蛋白質親疏水性一定程度上決定蛋白折疊方式，是蛋白質空間結構因素之一，在蛋白特定功能上發揮重要作用。使用ProtScale分析HaFAB2編碼蛋白氨基酸序列親疏水性。＞0部分高于50%為疏水性蛋白，而＜0部分高于50%為親水性蛋白，可知HaFAB2編碼蛋白為親水性蛋白（見圖5）。

圖5 向日葵HaFAB2編碼蛋白質親/疏水性分析Fig.5 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

2.3 HaFAB2基因表達分析

測定向日葵種子不同發育時期油酸含量，高、低油酸含量的兩份向日葵材料在種子發育過程中油酸積累變化趨勢一致，但稍有不同，在向日葵種子發育初期至中期（開花后7 d到開花后22 d），隨發育時間增加，油酸含量均迅速增長，“L-1-OL-1”在開花后22 d油酸含量有小幅增長，開花后37 d油酸含量達最高值。而“86-1”在22DAF油酸含量達最高，之后油酸含量下降，開花后27 d趨于穩定（見圖6A）。

通過qRT-PCR檢測向日葵HaFAB2基因在高低油酸向日葵種子不同發育時期以及“L-1-OL-1”在開花后7 d根、莖、葉、管狀花、舌狀花表達量。結果表明，HaFAB2在各部位均有不同程度表達，發育早期種子和成熟葉中表達較高。7DAF-17DAF兩份材料種子中表達量均較高，且均在17DAF種子中表達量最高，此時“L-1-OL-1”明顯高于“86-1”，油酸積累變化趨勢（見圖6A）結果表明，7DAF-17DAF種子油酸處于逐漸積累時期，可看出，HaFAB2基因表達量與油酸積累變化趨勢一致。17DAF之后，HaFAB2基因在大部分發育時期種子中較低表達，但在27DAF“86-1”種子中較高表達量，此時明顯高于“L-1-OL-1”（見圖6B）。

圖6 向日葵HaFAB2基因表達分析Fig.6 Expression analysis of HaFAB2 in sunflower

3 討論與結論

Δ9硬脂酰-ACP脫氫酶基因FAB2使硬脂酸脫飽和后形成油酸。由于FAB2催化去飽和作用是植物不飽和脂肪酸生物合成第一步，在很大程度上決定植物中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例。在玉米種子中過表達FAB2同源基因ZmSAD1，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例提高20.40%～20.61%[14]。在棉花中利用RNA介導基因沉默技術干擾FAB2同源基因SAD表達，硬脂酸含量從20%提高到40%[15]。在大豆中，通過抑制FAB2基因，可增加硬脂酸含量[16]。異位表達花生FAB2提高酵母體內油酸含量[17]。Kachroo等研究擬南芥FAB2突變體，發現突變體油酸含量偏低[18]。本研究克隆向日葵HaFAB2基因，并分析基因生物信息學和研究表達模式，為進一步研究HaFAB2基因功能提供參考，為通過分子育種手段改良向日葵油品質建立基礎。

在大部分高等植物中，FAB2在各器官中均表達，但表達模式不同。FAB2同源基因SAD在油樟種子、葉和花中表達量較高，但在根和莖中表達量低[19]。在花生克隆的3個FAB2同源基因中，FAB2-1與FAB2-2在種子中表達量較高，隨種子發育兩者表達水平持續升高；FAB2-3在花中表達量較高，僅在種子發育早期呈上調表達趨勢[17]。而海濱錦葵SAD在葉中表達量最高，其次是種子、莖和花中表達量最低，且隨種子發育表達量逐漸降低[20]。GhSAD2基因在棉花葉片中表達量高于莖和根；GhSAD2基因在棉花種子發育過程中表達量呈先升后降趨勢，在花后25 d種子中表達量最高，在成熟種子中表達相對較弱[21]，與本研究結果相近，本研究HaFAB2基因在各部位均表達，尤其是葉、種子中表達量較高，在7DAF-17DAF兩份材料種子中表達量均較高，種子中油酸快速積累，且Ha-FAB2均在17DAF種子中表達量達到最高，此時高油酸材料中表達量明顯高于低油酸材料，HaFAB2催化硬脂酸生成油酸，因此其表達越高油酸積累較多，可看出HaFAB2基因表達量變化與油酸積累變化趨勢一致，推測HaFAB2基因是影響油酸含量的重要基因。目前已利用人工誘導的FAD2突變體選育出高油酸向日葵品種Pervenets，將葵花籽亞油酸含量從66%降低到30%（單基因突變體）和12%（雙基因突變體），油酸含量從20%分別上升至60%和80%[22]。目前，各國高油酸向日葵品種多是以Pervenets為基礎材料育成。FAD2突變顯著提高種子油酸含量，若在向日葵fad2突變體中過表達Ha-FAB2，理論上可提高種子中總不飽和脂肪酸和油酸含量，基因編輯技術發展將帶動培育出更多高油酸向日葵新品種。

FAB2還與多種生理生化反應以及抗脅迫相關。擬南芥FAB2突變體內硬脂酸（C18∶0）含量增加，油酸（C18∶1）含量減少，提高水楊酸與茉莉酸介導的抗病反應[23]。過表達小麥FAB2同源基因TaSSI2，轉基因擬南芥植株對白粉病抗性降低[24]。低溫下培養甘藍型油菜FAB2的一個同功基因上調表達，導致硬脂酰ACP去飽和酶含量增加[25]。RNAi的GhSAD2轉基因棉花植株相比對照，其抗寒能力減弱，耐熱能力增強[21]。FAB2基因還與植物抗炭疽病菌和植物激素信號轉導等密切相關[26-27]。本研究中在17DAF之后，HaFAB2基因在大部分發育時期種子中表達較低，但在27DAF“86-1”種子中表達量較高，可能與某種生理生化反應及脅迫相關，值得未來深入研究。本試驗初步研究HaFAB2基因在高低油酸種子表達模式，推測其在調控向日葵脂肪酸合成尤其是油酸合成可能發揮功能，但需通過轉基因等技術驗證。