魚類性別調控機制的研究進展

韓 ，藺佳文，韓 英

（東北農業大學，哈爾濱 150030）

脊椎動物的性別決定機制包括基因性別決定機制（genetic sex determination，GSD）、環境性別決定機制（environmental sex determination，ESD）和基因-溫度性別決定機制（genetic sex determination+temperature effect，GSD+TE）［1］。由于進化水平的不同，其性別決定機制不同。遺傳性別決定機制一般為進化程度較高的動物，如鳥類、哺乳動物等；而爬行類等較低等的脊椎動物，則是環境性別決定機制的代表；魚類受基因、環境兩種決定機制的影響，多數為基因-溫度性別決定機制。

1 脊椎動物的性別決定機制

1.1 基因性別決定機制

基因性別決定機制是指動物的性別分化方向不受外部環境因素的影響，由性染色體上的遺傳基因來決定。性別決定基因本身不參與性別的分化，只能控制其“決定過程”，并且啟動一系列性別分化事件［2］?；蛐詣e決定過程是一系列相互作用的復雜生化過程，該過程最終引起性細胞的決定和分化，途徑內的某些成分或成分組合可能成為影響性別決定方向的主導因素。在大多數兩性魚類上也類似，性別決定過程通常是由性染色體上的單基因或者是多基因引起的一系列級聯信號通路，誘導原始生殖性腺分化［3］。單基因是指動物的性別是由位于某條特定的染色體上的單個基因決定的，其他遺傳基因座不會覆蓋其影響；多基因是指由基因組中涉及性別決定的所有遺傳因素共同參與了性別決定分化，位于同一染色體上或聚集在同一個基因座上［4］。此類作用機制同樣存在于魚類中。

鳥類和哺乳類等進化程度較高的脊椎動物，其性別決定機制就屬于基因性別決定機制?；蛐詣e決定機制分為兩種：1）雌性同配（XX），雄性異配（XY），如哺乳類；2）雌性異配（ZW），雄性同配（ZZ），如鳥類（平胸類除外）。魚類的性別決定機制原始、復雜，不同種類間的染色體類型存在很大差異，常采用基因標記法、人工雌核發育、誘發性逆轉等細胞學以外的方法確定性別類型。魚類的基因性別決定機制大致分為五類：雄性異配型（XY），大多數魚類性染色體屬于此類型，如虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、胡子鯰（Clarias fuscus）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）等；雌性異配型（ZW），如半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）、劍尾魚（Xiphophorus helleri）、大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）；雄性配子異配型（XX／XO），某一個性別少一條性染色體的魚類，如褶胸魚（Sternoptyx diaphana）；雌性配子異配型（ZO／ZZ），如短頜鱭（Coilia brachygnathus）；復 性 染 色 體 型（X1X1X2X2／X1X2Y），目前僅在魚類中發現此類型，如花鰍（Cobitis taenia Linnaeus）等；常染色體型，如斑馬魚（Danio rerio）。

1.2 環境性別決定機制

低等的脊椎動物進化程度低，性別決定方式具有多樣性。一些低等動物雌雄兩種性別中的性染色體幾乎沒有差異性，有的甚至沒能進化出所謂的性染色體，無法進行性別決定。因此在早期胚胎發育的過程中，溫度或營養狀況等外界環境因子的改變完全地覆蓋或者取代了遺傳因素的作用，成為性別決定和分化的重要影響因素［4］。在眾多環境因子中，溫度依賴型性別決定機制（temperature-dependent sex determination，TSD）最常見。溫度依賴型性別決定機制是指環境溫度在一定程度上可以影響動物的性別分化方向，一些爬行類如美洲短吻鱷、兩棲類、魚類如白氏銀漢魚（Atherina bleekeri Günther）就屬于這種性別決定機制。TSD主要分為三種模式：第一種是FM模式，低溫產生雌性后代，高溫產生雄性后代，即Ⅰa型；第二種是MF模式，低溫產生雄性后代，高溫產生雌性后代，即Ⅰb型；第三種是FMF模式，高溫和低溫均產生雌性后代，中間溫度產生雄性后代，即Ⅱ型［5］。例如，美洲短吻鱷卵在33℃下100%孵化為雄性，在30℃以下則雌性比例更高；烏龜卵孵化溫度在20～27℃為雄性，在30～35℃為雌性［6］。

1.3 基因-溫度性別決定

魚類性別除了受性染色體上dmy基因、dmrt1、sf1、amh等常染色體上性別決定基因控制外，外界環境的影響也很大。其中溫度性別決定機制（TSD）在環境因素影響中起重要作用。有試驗證據的魚類中僅有40種屬于TSD型，其余19種魚類為基因-溫度性別決定機制（GSD+TE）［7］。魚卵在孵化的過程中會出現一個特殊時期，稱為溫度敏感期（temperature sensitive period，TSP），在溫度敏感期人為升高或降低溫度可忽略遺傳因素的影響改變性別分化方向和性別比例，甚至還會出現性別逆轉現象。例如，尼羅羅非魚在受精9 d后進入溫度敏感期。在此期間進行高溫36℃處理，一定比例的遺傳性雌魚會逆轉為生理性雄魚。經VASA免疫組織化學染色顯示，高溫處理的尼羅羅非魚性腺在受精后21～39 d由卵巢型變為睪丸型；在受精后99 d高溫處理的遺傳性雌魚的性腺變為真睪丸［8］。牙鲆（Paralichthys olivaceus）的溫度敏感期為受精后30～100 d，研究表明，在此期間進行27℃高溫處理，雌魚100%性逆轉為雄魚，性逆轉雄魚的性腺Cyp19a1a基因表達受到抑制［9］。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）在20℃溫度下進行正常的性腺分化，雌雄比例為1∶1；在25～30℃高溫處理下，80%發育為雄性。許氏平鲉（Sebastes schlegelii）在溫度較高時性腺偏雌性發育；反之性腺偏雄性發育［10］。

2 環境對魚類性別決定的影響

相對于進化程度較高的脊椎動物穩定的性別決定系統，魚類的性別決定更加靈活。魚類的性別決定系統是以遺傳為基礎的，同時受環境因子的影響。這些環境因子包括生物和非生物兩種因素。生物因素包括病原體等；而非生物因素則為水溫、光照強度、外源激素、氧氣含量、pH值等。這些環境因素都能在不同程度上影響魚類的性別分化，其中溫度和外源激素是目前最受關注且影響范圍較廣的兩種環境因子，尤其在魚類性別決定和分化的關鍵時期具有十分顯著的作用。

2.1 溫度對魚類性別決定的影響

銀漢魚的性別分化遵循一種完全溫度依賴型性別決定機制（TSD），高溫下雄性比例大，而低溫下雌性比例大。此外，大多數魚類為基因-溫度性別決定機制（GSD+TE），是在基因調控的基礎上，改變環境溫度使其中一部分性別分化方向發生改變。尼羅羅非魚的性別決定系統主要是XX／XY，但是當在其溫度敏感期進行高溫36℃處理時，XX雌性羅非魚會性逆轉為生理性雄魚，且無論溫度進一步升高還是低溫誘導，都不會進一步增加雄魚比例。有研究證明，尼羅羅非魚的溫度敏感性為一種可遺傳的性狀［11］。在莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）的溫度敏感期進行20℃低溫處理，會導致XY雄魚逆轉為生理性雌魚。這說明不同種類的魚對溫度的敏感度不同。

2.2 類固醇激素對魚類性別決定與分化的影響

性類固醇激素是影響魚類性別決定與分化的首發因素之一，在雄魚中指的是以睪酮為主的雄激素，在雌魚中主要指的是雌激素和孕激素，它們影響生殖細胞及其他細胞的發育，參與性分化器官和第二性征的出現。內源性類固醇激素對魚類性別分化影響存在著兩種假說［4］；第一種是1987年由Bogart提出的平衡假說。該假說是指早期魚體內雌雄激素比例決定魚類性別，雌激素水平高則發育為雌性，反之則發育為雄性。研究表明，用40μg／g的17β-雌二醇處理出膜后3～20 d的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco），雌性率達到100%；用20 mg／kg的雌二醇處理出膜10 d后的黃顙魚，雌性率達到83.6%［12］。另一種是缺失假說，即雌激素在魚類性別分化中起關鍵性作用，若在魚類性別分化關鍵時期有雌激素的合成，則為雌性，反之為雄性。例如，編碼類固醇生成酶17β-羥基類固醇脫氫酶1（Hsd17b1）基因的錯義SNP與梭魚的ZZ／ZW 性別決定完全相關，Hsd17b1 mRNA在梭魚未分化性腺和分化性腺中呈結構性表達，而W 型mRNA僅在基因型雌性性腺中表達，所以Hsd17b1等位基因的組合通過調節梭魚的內源性雌激素水平來 決 定 性別［13］。此外，cyp19a1a、3β-hsd、P450scc、P450c17等雌激素合成相關基因在雄魚苗內不表達，僅在雌魚苗中表達。由此可見，在魚類早期性別分化過程中首先出現雌激素，并且雄魚體內沒合成類固醇激素。

3 魚類性別逆轉研究現狀

動物個體性別相互轉化的現象稱為性逆轉，又稱為性反轉。脊椎動物中性逆轉被認為是基因型和表型的錯配，在魚類的個體生長發育過程中溫度、外源激素以及行為等均會影響魚類的性別分化，使遺傳性別發生逆轉［4］。由于一些魚類雌雄同體，魚類中存在天然性逆轉現象。先為雌性，即第一性成熟為雌性的卵巢，之后逆轉為雄性的精巢，稱為“首雌特征”，如石斑魚類等；先為雄性，具有精巢組織，然后轉變為雌性卵巢，稱為“首雌特征”，如海產鯛科魚類。雌雄異體的魚類有些也會自然地發生性逆轉，當前研究認為，斑馬魚性腺早期均為不成熟的卵巢，在受精后25～60 d內，雄性通過凋亡基因控制使卵巢凋亡并誘導其轉化為睪丸，而雌性則通過抗凋亡基因途徑來抑制凋亡［14］。隨著現代育種技術的發展，可以利用外源因素人工誘導魚類性逆轉，將遺傳性雄魚誘導為生理性雌魚或遺傳性雌魚誘導為生理性雄魚，如在30 d牙鲆的飼料中添加10μg／g 17α-甲基睪酮70 d，雌魚成功發生性逆轉［9］。

3.1 誘導雄魚性逆轉研究

目前主要利用外源性雌激素來誘導雌魚性逆轉。常用的外源性雌激素有雌酮E1（Oestrone）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）、17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinyl estradiol）、EBA（Oestradiol butyryl acetate）、EB（Oestradiol benzoate）、乙烯雌酚DES（Stilbestrol）等。例如，雄性尼羅羅非魚在17α-乙炔基雌二醇誘導下會發生完全性逆轉。外源激素的使用方法分為急性方法和慢性方法兩種。急性方法包括注射（肌肉或體腔）、投喂、浸泡或者混合使用；慢性方法包括飼料添加、制成膠囊或顆粒藥物、埋植法等。每種方法均有優缺點，針對魚類及外源激素類型決定。在魚類性別決定早期進行外源激素的處理，可以誘導表型性別永久逆轉。這個性別決定永久轉換時期，稱為性別敏感期。在對外源激素的敏感程度上，生理學性腺分化期最敏感，組織學性腺分化期次之。性別敏感期過后雄魚會產生雄激素。因此，在利用外源激素誘導雄魚性逆轉時要掌握好性別敏感期，提高性逆轉比例［15］。

3.2 誘導雌性性逆轉的研究

雄激素可以使雌魚發生性逆轉現象。雌性虹鱒在雄激素處理后可以性逆轉為雄性；尼羅羅非魚、斑馬魚、大鱗大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）等甚至可以達到100%雄性率。常用的誘導雌魚性逆轉的雄激素類藥物有17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone，MT）、17α-乙炔基睪酮（17α-ethinyl testosterone）和雄烯二酮（androstenedione）、11-KT（11-Ketotestosterone）、T（Testosterone）等。利用50μg／g MT處理雌性羅非魚后100%逆轉為雄性；用400μg／L MT處理孵化期的大鱗大麻哈魚，也可以得到100%的轉化率［16］。雌激素是誘導卵巢發育的重要因素，雌雄反轉與雌激素水平的降低有著密不可分的關系。芳香化酶催化雄激素轉化產生雌激素，在硬骨魚類性腺分化中起重要作用，因此經常利用芳香化酶抑制劑來誘導雌魚性逆轉。芳香化酶抑制劑分為以下幾種：雄烯二酮衍生物，如睪酮等；三唑衍生物，來曲唑（Letrozole）等；使用含有500μg／g法曲唑（Fadrozole）的飼料飼喂三斑海豬魚（Halichoeres trimaculatus）雌魚，飼喂5 d后卵巢發育異常，飼喂10 d后全部轉變為雄性。芳香化酶抑制劑還可以使已經完成性腺分化的成年魚發生性逆轉，但是處理時間較長，如青鳉魚等。常用的芳香化酶檢測的方法有酶活性分析法、原位雜交法、RT-PCR和免疫組化法等。

3.3 性逆轉與分子生物學研究

RNA-seq隨著技術的成熟和功能的強大，已經廣泛應用于魚類轉錄組研究中。F.Y.Sun［17］等通過RNA-seq技術對斑點叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）的精巢進行分析，共計鑒定出約25 307個功能基因，其中有167個為首次在斑點叉尾鮰中鑒定到的基因。在對精巢和卵巢的轉錄本分析中發現，Sox9、Dmrta2、Amh等為性腺發生、精巢的發育和精子發生的雄性偏向基因。在對密西西比鏟鱘（Scaphirhynchus platorynchus）性腺的研究中發現，Dkk1和Dact1是僅存在于卵巢中的性別特異性基因，可以作為密西西比鏟鱘性別分化和性腺發育研究中的性別標記。為了探究ERK和JNK兩個MAPK家族中的兩個主要亞族在黃鱔雌雄發育中的表達和定位，運用蛋白質免疫印跡雜交技術和免疫組織化學法對ERK和JNK進行檢測。蛋白免疫印跡雜交結果顯示，JNK的表達量低于ERK，ERK在黃鱔的雌雄性腺中均強表達。相比于精巢組織，JNK1在卵巢中表達更強，JNK2則在精巢、卵巢組織中表達差異不顯著。免疫組織化學的研究結果顯示，在精原細胞和卵原細胞中ERK和JNK呈陽性反應且定位類似；細胞質、細胞核核質呈陽性反應，核仁呈陰性反應。ERK和JNK在卵母細胞細胞質中的陽性反應隨著卵母細胞的生長和成熟逐漸減退。該研究表明ERK和JNK在黃鱔的卵巢發育和凋亡，雄性發育的啟動過程中具有重要作用［18］。Cyp19a1a是硬骨魚中產生17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的關鍵基因。通過免疫組織化學方法和雙熒光素酶測定法研究發現，Cyp19a1a在卵巢中的表達高于精巢。首次鑒定了一個miRNA，命名為360miR-26a-5p，研究表明它通過與Cyp19a1a直接進行相互作用，對E2進行調節，同時篩選出了在性逆轉高表達量的miRNA候選基因［19］。

4 總結

隨著對魚類性別調控機制、性逆轉現象和分子生物學的研究，人們對魚類性逆轉也有了許多新的認識。魚類性別調控機制十分復雜，性逆轉的影響因素也是多方面的。目前誘導魚類性逆轉的方法很多，但是有些理論基礎仍然欠缺，許多方法仍然處于試驗階段，并不能大規模投入生產。筆者認為，魚類性逆轉的研究方向應集中在外源激素對魚類性逆轉的最佳誘導時期、利用模擬生態條件對魚類性逆轉進行調控、運用現在分子生物學技術探究有關魚類繁殖和性逆轉基因及作用途徑，從而進一步研究魚類性別調控機制和誘導魚類性逆轉方法。