黃海南部海域不同類群微型浮游原生生物生長對亞洲沙塵和磷添加的響應?

晨 曦， 劉光興,2， 白曉巖， 史冬婉， 張 潮,2， 趙陽國,2??， 高會旺,2

(1.中國海洋大學環境科學與工程學院，山東 青島 266100； 2.中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100；3.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

海洋微型浮游原生生物的粒徑一般為2～20 μm，是微型食物環的重要組成，對有機質分解和營養鹽再生有著重要貢獻，在海區營養鹽的補充和初級生產力的維持方面均發揮著不可替代的作用[1-5]。原生生物種類龐雜，準確分類鑒定十分困難，使對其生態特征和功能的深入研究受到極大限制，而且，原生生物的營養代謝涵蓋自養、異養和兼養等多種營養類型[4-8]，使其生態功能更加復雜，如果通過粒徑和營養方式劃分功能類群，可以更清晰地表明其在不同生態系統中的生態作用，這種概念目前已逐漸被廣泛接受[6,9-12]。

黃海是中國四大邊緣海之一，自然資源十分豐富、沿岸經濟發達，也是陸地、海洋和大氣等各種過程相互作用較為激烈的海區，一直備受海洋學者的關注[13]。沙塵沉降是陸源營養物質和污染物向海洋輸送的重要途徑，是海洋中限制性營養元素的重要來源[14-17]。亞洲沙塵指源于中亞和東亞地區的沙塵，是全球沙塵的重要組成部分[14]。亞洲沙塵天氣中大量沙塵顆粒從中國西北部長距離輸運后沉降入黃海[14,17]，對近海和大洋營養鹽的貢獻(如鐵、氮、磷等)是沙塵影響海洋生態系統的主要方面[14]。黃海又是主要受P潛在限制的海區，在南黃海以秋季最為突出[18]，營養鹽的變化會導致海洋生態系統發生諸如原生生物的營養習性、群落結構改變等問題，使其對營養物質的利用與轉化能力發生變化，并進一步影響其生態功能的發揮[1,19]。

為探討沙塵沉降和P添加對南黃海微型浮游原生生物的影響及沙沉降作用與P溶出之間的關系，本研究于2014年11月在南黃海海域進行了現場模擬培養實驗，通過分析不同粒徑級和營養類型浮游原生生物生長速率的變化，研究不同類群原生生物生長對沙塵和P添加的響應，以期為深入探討沙塵沉降對海洋微型生物種群結構和生態功能的影響及作用機制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 沙塵采集與處理

內蒙古渾善達克沙地是我國北方起塵總量較高的沙地[20]，在內蒙古沙地產生的沙塵所影響的中國近海海區中，黃海是影響可能性最大的海區[17]，因此本研究采用來自內蒙古渾善達克沙地(42°22′28″N，112°58′34″E)的沙塵。沙塵于2011年5月采集表層土壤，-20 ℃冷凍保存。在實驗室經20 μm篩網過篩后，再進行人工老化處理[21]。用ICS-1100離子色譜儀(美國安捷倫公司)分析其中營養鹽與重金屬含量，總有機碳采用高溫燃燒氧化法由島津 TOC-V 型總有機碳測定儀測定[22]，結果見表1。

表1 實驗用沙塵中營養鹽、DOC及溶解性微量元素的濃度Table 1 Concentrations of nutrients, DOC, dissolved trace metals in the dust

1.2 沙塵沉降模擬培養體系的建立與培養

于2014年11月搭載“東方紅2號”科考船在黃海南部H03站(36°06′00″N，121°39′00″E)采集現場海水進行沙塵沉降的隨船模擬培養實驗，采樣站位見圖1。使用船載CTD采水器(Seabird 911，USA)采集表層海水，將采集到的海水立即用20 μm篩絹過濾以除去大、中、小型浮游生物。將過濾海水分裝至1.5 L的無菌PET培養瓶中，將培養瓶置于固定在甲板上周圍無遮光影響的水槽中進行船基模擬培養，水槽中通入現場循環海水以維持培養水溫。

圖1 培養站位Fig.1 Location of incubation stations

培養實驗分5組進行，分別為對照組(Control)、低沙塵添加組(LD)、高沙塵添加組(HD)、低磷添加組(LP)和高磷添加組(HP)，所添加的沙塵和營養鹽量以歷年在黃海海域觀測所得數據為參考[23]，各實驗組的添加量見表2。每個船基培養實驗均設置3個平行實驗組，培養周期為5天，培養期間每天采樣1次。沙塵和磷酸二氫鈉(P)均在培養體系建立后立即一次性添加。

表2 培養組沙塵和營養鹽添加量Table 2 Experimental groups and concentration

1.3 樣品采集與測定

微型浮游原生生物樣品 于培養期間的每天上午8∶00采集樣品，取樣前先緩慢將PET培養瓶倒置3次以上，使培養體系中的微型浮游生物均勻分布。無菌取培養瓶中水樣各10 mL，分別加入無菌凍存管中，立即加入10%多聚甲醛固定(終濃度為0.5%)，輕微顛倒混勻后立即置于液氮瓶中迅速冷凍，再轉入-80 ℃超低溫冰箱中保存，每次均取3個平行樣。

微型浮游原生生物數量的測定采用BD C6 plus流式細胞儀進行。樣品經SYBR Green Ⅰ染色，激發光波長為488 nm，綠色熒光(FL1，波長(530±20) nm)為染色熒光，紅色熒光(FL3，波長>630 nm)為自發熒光。FL1熒光信號強、FL3熒光信號弱為異養型，FL3熒光信號強為自養型，FL3熒光信號弱于自養型但強于異養型為兼養型。測定樣品時加入2、5和10 μm標準微球確定樣品在流式細胞儀上的粒徑范圍，按2～5 μm(小粒徑)、5～10 μm(中粒徑)和10～20 μm(大粒徑)3個粒徑級分別計數3種營養型的原生生物數量。

原生生物生長速率計算公式為μ=(lnNt-lnN0)/(t-t0)。式中：μ為比生長速率(d-1)；N0、Nt分別為單位水體中原生生物的起始數量和培養t天后的數量(cells·cm-3)[24]。

溶解有機碳 在采集培養體系用海水的同時，另采集CTD采水器的現場水樣，用經450 ℃灼燒12 h處理的GF/F 濾膜(Whatman，UK)過濾后裝入經同法高溫燒灼處理的50 mL玻璃瓶，4 ℃避光保存，帶回實驗室用高溫燃燒氧化法由島津 TOC-VCPN 型總有機碳測定儀測定[22]。

1.4 數據處理與分析

采用 SPSS 軟件(SPSS Inc., Chicago IL)中多因素方差分析法分析培養體系中各分組之間結果的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 培養站位H03的環境特征

2.2 10～20 μm微型原生生物生長對沙塵和磷添加對的響應

10～20 μm不同營養型微型原生生物生長對沙塵和磷添加的響應見圖2，各組自養、異養和兼養型原生生物生長速率的變化見圖2。由圖2可見，10～20 μm原生生物在培養期間的生長速率除沙塵組異養和兼養型是先降低后升高外，其他各組均具有先增加后降低的趨勢，但不同濃度沙塵和磷添加組與對照組相比生長速率的變化較大。對照組C組在培養第1天，自養、異養和兼養型原生生物的生長速率分別為0.26、0.71和0.90 d-1，培養結束時分別為0.08、-0.71和-0.71 d-1。

(注：“*”代表具有高度顯著性差異?！?”Represent highly significant difference.)

圖2 10～20 μm各組自養(a)、異養(b)和兼養(c)型原生生物的生長速率
Fig. 2 Growth rate of phototrophic(a), heterotrophic(b) and mixotrophic(c) nanoplanktonic protists 10～20 μm in size

P添加組在培養第1天，自養型HP、LP組的生長速率分別為1.39和0.96 d-1，分別是對照組的5.35和3.69倍(P<0.05)；異養型HP組、LP組的生長速率分別為2.12、1.27 d-1，分別是對照組的2.99和1.79倍(P<0.05)；兼養型HP組、LP組的生長速率分別為1.84和1.31 d-1，分別為對照組的2.04和1.46倍(P<0.05)。培養結束時，自養型HP、LP組的生長速率分別為-0.41和0.29 d-1，異養型分別為-2.26和-0.2 d-1，兼養型分別為-1.51和0.59 d-1；高P添加組各營養類型的原生生物生長速率均為負增長，顯著低于C組(P<0.05)，低P組均略高于C組，但差異不顯著。

沙塵添加組在培養第1天，10～20 μm不同營養類型原生生物生長速率的變化有所不同。自養型原生生物在HD、LD組的生長速率分別為0.69 和0.47 d-1，明顯高于C組(P<0.05)，分別為C組的2.65和1.81倍，但均低于P添加的各組，異養型原生生物在HD、LD組的生長速率分別為-0.20和-0.33 d-1，均低于對照組且表現為負增長(P<0.05)；兼養型在HD、LD組的生長速率分別為0.12和0.13 d-1，均低于對照組(P<0.05)培養結束時，各沙塵添加組10～20 μm不同營養類型原生生物生長速率差異較大，自養型HD、LD組的生長速率分別為-0.12和0.10 d-1，低沙塵組顯著高于對照組(P<0.05)，但高沙塵組為負值，顯著低于對照組(P<0.05)；異養型HD、LD組分別為0.71 和0.17 d-1，兼養型分別為1.11和0.53 d-1，沙塵組均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 5～10 μm微型原生生物生長對沙塵和磷添加的響應

5～10 μm自養型、異養型和兼養型微型原生生物生長對沙塵和磷添加的響應見圖3。由圖3可見，5～10 μm各組原生生物在培養期間的生長速率的變化趨勢與10～20 μm的基本相同，但變化幅度差異很大。特別是C組在培養第1天自養、異養和兼養型原生生物的生長速率分別為-0.35、0.31和-0.04 d-1，在培養結束時分別為-0.49、-1.12和0.29 d-1，培養期間增長率變化不大或以負增長為主，主要與培養期間上一營養級的捕食壓力有關[26]。

HP、LP組在培養第1天，自養型的生長速率分別為1.31和0.56 d-1，異養型分別為2.02和1.19 d-1，兼養型分別為1.09和0.53 d-1，P添加組各營養類型的生長速率均明顯高于對照組(P<0.05)，各HP組的增加幅度顯著大于LP組(P<0.05)，其中自養型原生生物生長速率的增幅最為明顯。培養結束時，自養型HP、LP組的生長速率分別為-0.07和-0.16 d-1，異養型分別為-2.45和-0.15 d-1，兼養型分別為-1.02和0.92 d-1；高P添加組各營養類型的原生生物生長速率均為負增長，顯著低于C組(P<0.05)；低P組各營養型均高于C組(P<0.05)。

沙塵添加后在培養第1天，5～10 μm不同營養類型原生生物生長速率的變化也不盡相同。HD、LD組自養型原生生物的生長速率分別為0.40和0.20 d-1，異養型分別為-0.86和0.05 d-1，兼養型分別為-0.33和-0.57 d-1。培養結束時，各沙塵添加組5～10 μm原生生物生長速率與對照組相比變化很大，自養型HD、LD組的生長速率分別為0.04和-0.37 d-1，異養型分別為1.63和0.10 d-1，兼養型分別為1.16和0.53 d-1，沙塵添加的各營養類型組原生生物生長速率均高于C組(P<0.05)，且高沙塵組顯著高于低沙塵組(P<0.05)，特別是對異養型和兼養型的促進作用更加顯著。

(注：“*”代表具有高度顯著性差異?！?”Represent highly significant difference.)

圖3 5～10 μm各組自養(a)、異養(b)和兼養(c)型原生生物的生長速率
Fig. 3 Growth rate of phototrophic(a), heterotrophic(b) and mixotrophic(c) nanoplanktonic protists 5～10 μm in size

2.4 2～5 μm微型原生生物生長對沙塵和磷添加的響應

沙塵和磷添加下2～5 μm自養型、異養型和兼養型微型原生生物生長速率的變化見圖4。

2～5 μm自養型、異養型和兼養型微型原生生物對沙塵和磷添加的響應見圖4。對照組在培養第1天的自養、異養和兼養型原生生物的生長速率分別為0.02、0.27和0.11 d-1，培養結束時分別為0.46、-0.46和0.18 d-1。

在培養第1天，HP、LP組自養型的生長速率分別為0.96和0.56 d-1，異養型分別為1.40和0.85 d-1，兼養型分別為1.12和0.68 d-1，P添加組各營養類型的生長速率均明顯高于對照組(P<0.05)，且HP組顯著大于LP組(P<0.05)，其中異養型原生生物生長速率最高，其次為兼養型。培養結束時，自養型HP組、LP組的生長速率分別為-0.72和0.16 d-1，異養型分別為-0.82和0.13 d-1，兼養型分別為-0.21和0.47 d-1，高P添加組各營養類型的原生生物生長速率均為負增長，顯著低于C組(P<0.05)；低P組除自養型外均高于C組(P<0.05)。

(注：“*”代表具有高度顯著性差異?！?”Represent highly significant difference.)

圖4 2～5 μm各組自養(a)、異養(b)和兼養(c)型原生生物的生長速率
Fig. 4 Growth rate of phototrophic(a), heterotrophic(b) and mixotrophic(c) nanoplanktonic protists 2～5 μm in size

2～5 μm各營養類型原生生物生長對沙塵添加響應不同。在培養第1天，自養型原生生物在HD、LD組的生長速率分別為0.31和0.17 d-1，明顯高于C照組(P<0.05)，但均低于P添加的各組。該粒徑異養型原生生物在HD、LD組的生長速率分別為-0.06和0.10 d-1，兼養型分別為-0.04和-0.29 d-1，以負增長為主，均顯著低于對照組(P<0.05)。培養結束時，2～5 μm沙塵添加組不同營養類型原生生物生長速率變化差異較大，自養型HD、LD組的生長速率分別為-0.15 和-1.10 d-1，異養型分別為0.84和0.40 d-1，兼養型分別為0.68和0.01 d-1。

2.5 沙塵和P添加對不同原生生物類群組成的影響

沙塵和P添加的各實驗組和對照組原生生物各粒徑級和營養型組成結構變化見圖5。由圖中結果可以看出，不同類群原生生物的組成構成變化存在明顯差異。培養第1天，HD、LD兩個沙塵添加組自養型原生生物的增加幅度最為顯著，其中5～10 μm所占比例增加幅度最大，分別為對照組的2.00和2.25倍(P<0.05)，而2～5 μm自養型原生生物所占比例最大，分別為27.80%和26.50%，但較C組增加的幅度小于5～10 μm組，分別為C組的1.50和1.43倍(P<0.05)；P添加的HP、LP組5～10 μm自養型和異養型的增幅較大，自養型分別為C組的1.75、1.25倍(P<0.05)，異養型分別為C組的1.86、1.33倍(P<0.05)；HP組10～20組異養型也有較C組明顯增加，為C組的1.40倍(P<0.05)。

(注：“*”代表具有高度顯著性差異?！?”Represent highly significant difference.)

圖5 不同粒徑級和不同營養型原生生物的構成比變化
Fig.5 Abundance structure of nanoplanktonic protists in different size and trophic types

培養結束時，各實驗組異養型所占比例和增幅都較對照組顯著增加，HD、LD組5～10 μm異養型分別是對照組的7.20和5.80倍(P<0.05)，增幅最大，10～20 μm的增幅次之，分別是對照組的4.0和3.00倍(P<0.05)，2～5 μm異養型原生生物所占比例的增幅較小，但其所占比例最大，分別占43.10%和47.90%，是該粒徑級的優勢類群；在培養結束時各粒徑級兼養型原生生物所占比例也有明顯變化，特別是HP、LP組2～5 μm兼養型原生生物比例的變化最為顯著，分別占52.0%和51.3%，分別為C組的1.25和1.23倍(P<0.05)，成為所在組中絕對的優勢類群；10～20和5～10 μm兼養型原生生物在LP、LD組的比例也有顯著增加，10～20 μm分別為C組的3.80和1.40倍(P<0.05)，5～10 μm分別為C組的1.41和1.36倍(P<0.05)。

3 討論

3.1 南黃海海區不同粒徑級和不同營養型原生生物的P限制

3個粒徑級的原生生物生長速率在P添加組初期各營養型均明顯高于對照組，高磷組增幅大于低磷組，自養型生長速率的增加量顯著高于其它營養型，表明該海區各粒徑級不同營養類型的浮游原生生物生長均受P 的限制，P的添加會促進各營養類型浮游原生生物的生長，特別是對自養型10～20 μm級和異養型2～5 μm粒徑級的原生生物的促進作用最為顯著，P添加組自養型生物爆發性生長與體系中缺乏的P得到補充有關，表明大粒徑級自養型原生生物受P限制更加明顯，而在小粒徑級異養型的限制作用更加明顯。高P組不同粒徑級各營養類型原生生物生長速率在培養后期顯著降低，與前期高P添加組原生生物快速生長消耗了其所在環境中的營養物質，導致培養后期營養缺乏使其生長速率下降有關，且前期P添加量越高、原生生物生長率增加幅度越大，后期下降幅度也越大，表明P的一次性添加只能短期內促進原生生物的快速生長，如營養鹽得不到及時補充，后期會因營養缺乏而抑制其生長。有研究表明，南黃海秋季大部分海域N/P高達50～100，甚至更高，與高N/P(>100)的長江沖淡水和臺灣暖流等共同影響有關[27-28]；氮、磷營養元素不僅限制浮游植物的生長，而且還會改變浮游植物的種群結構，使其由小型向微型、微微型轉變[29]。本研究結果表明，研究海區不同粒徑級各營養型的原生生物均受P 的限制，其中10～20 μm自養型最為明顯，其次是2～5 μm粒徑級的異養型。對大粒徑級自養型原生生物而言，磷的可獲得性直接影響海區有機物的凈生產量、限制所在海區的食物產出量，也表明上行控制是南黃海大粒徑級自養原生生物生長的主要影響因素之一；而小粒徑級異養型原生生物的營養限制則會使其在溶解性有機碳的吸收和營養鹽再生等物質循環中發揮的作用受到一定影響。

3.2 沙沉降對不同粒徑級各營養型原生生物生長速率的影響及與P溶出的關系

沙塵添加對3個粒徑級異養和兼養型是抑制作用，特別是對5～10 μm兼養型的抑制作用更強，與沙塵中重金屬等有害物質的溶出對原生生物的毒害作用有關[14]。培養后期沙塵添加對異養和兼養型是促進作用，早期沙塵添加量越高、后期對異養和兼養型的增加幅度越大，特別是對中、小粒徑級兼養型原生生物在培養后期的促進作用最為顯著。表明異養和兼養型原生生物在培養后期對沙塵中溶出的有害物質的影響逐漸耐受，前期因生長被抑制所消耗的營養較少，加之沙塵中包括Fe等微量元素和DOC等有機物溶出[27-30](見表1)，補充了培養后期營養物質的需求。沙塵添加對自養型原生生物生長具有顯著的促進作用，且變化趨勢與P添加組一致，特別是對10～20 μm的最為明顯，但最大增長率明顯低于P添加組，說明沙塵對原生生物生長的作用機制和P的相同，且可能與沙塵中P 的溶出有關[15]，但沙塵溶出的P較添加的P少，對原生生物生長的影響低于P添加組。培養后期沙塵添加對自養型原生生物表現為抑制作用，且前期促進作用越強、后期抑制作用越明顯，主要與其早期的過度生長造成后期營養缺乏而生長受到抑制有關。

3.3 不同粒徑級各營養型原生生物生長速率對P和沙塵添加的響應

以Kruskal-wallis秩和檢驗與Nemenyi-Wilcoxon-Wilcox秩和檢驗綜合分析各組中原生生物增長率變化可知，不同濃度沙塵和P對各粒徑不同營養型原生生物生長的影響順序均為HP>LP>C>HD>LD，其中不同濃度沙塵和P添加對各粒徑自養型原生生物生長率的影響早期為促進作用，后期為抑制作用。沙塵添加對不同粒徑自養原生生物生長速率影響的順序為10～20 μm>5～10 μm>2～5 μm；P對各粒徑異養型和兼養型原生生物生長率的影響為促進作用，沙塵早期為抑制作用，后期為促進作用；沙塵對異養和兼養型促進作用順序為異養>兼養型；對不同粒徑異養原生生物生長速率促進作用的順序為5～10 μm>2～5 μm>10～20 μm，表現為異養原生生物粒徑越小、對沙塵促進作用的響應越快；對不同粒徑異養原生生物生長速率抑制作用的順序為5～10 μm>10～20 μm>2～5 μm，表現為大粒徑異養原生生物對沙塵抑制的響應越快；沙塵對不同粒徑兼養型原生生物生長速率早期的促進作用和后期抑制作用的順序一致，均為10～20 μm>5～10 μm>2～5 μm，表明粒徑越大的兼養型原生生物對沙塵的影響越敏感。

3.4 沙塵和P添加對原生生物類群組成影響的生態意義

過去幾十年的研究已經越來越明顯的證明原生生物在海洋生態系統中扮演著極為重要的角色[31]。微型浮游生物在微食物網中占據了一個重要的營養節點[32-33]，在某些海區浮游原生生物對原核生物豐度控制和生物多樣性保持方面發揮著重要作用[34]。本研究沙塵和P添加早期對10～20 μm粒徑級自養原生生物生長速率的促進作用最為顯著，但該類群原生生物在所有類群中所占比例的變化與對照組相比沒有顯著性差異，表明沙塵和P的一次性添加對大粒徑自養型原生生物的促進作用持續時間較短，還不足以使其在所占比例上有顯著的持續提高，也可能與該粒徑級原生生物本身所占比較較少，所占比例增加幅度未能體現出統計學差異有關。自養型微型原生生物是浮游植物的重要組成部分，并貢獻了一部分初級生產力[5]。自養型原生生物的生長經常受到營養鹽的限制，營養鹽或DOC限制會改變原生生物的營養習性，使其對營養鹽或有機碳的利用與轉化能力發生變化，進而改變其生態功能[4,35]。

本研究在培養結束時2～5 μm異養型原生生物在沙塵組所占比例超過40%，成為所在該粒徑級的優勢類群，表明沙沉降對異養原生生物，特別是對小型異養原生生物群落的影響更加持久。異養型微型浮游原生生物攝食細菌、藍藻和更小的自養型原生生物[6～8]，通過選擇性攝食的調控作用對微型浮游生物的群落結構產生巨大的影響，而它自身也是小型、中型浮游動物的食物來源[36-39]，并作為食物網底部微生物往更高營養水平流動的通道[40-41]，在決定初級生產的物質能量流動上發揮著巨大作用。

兼養型原生生物是指在一個生物體內同時具有自養和異養能力的原生生物，在浮游原生生物中廣泛存在[4-5]，本研究在培養結束時10～20和5～10 μm兼養型原生生物分別在LP和LD組的比例有明顯增加，2～5 μm兼養型原生生物在P添加組占比超過50%，為所在該粒徑級的絕對優勢類群，表明P對小型兼養型原生生物群落的影響更加持久。

有研究報道海洋中5～20 μm 的鞭毛蟲攝食體型大于1 μm的生物[26]，因此本研究如果考慮上兩個營養級異養原生生物數量增加導致的捕食壓力增大，沙塵和P添加對2～5 μm異養和兼養型原生生物生長的促進作用可能更強。原生生物不同粒徑級和營養結構的改變對原生生物的攝食能力、攝食過程中所釋放的DOC及其化學組和對營養鹽的吸收轉化效率都將產生顯著影響，最終影響原生生物在該海區物質轉化和食物產出中的生態功能，將直接影響海洋碳循環及碳庫來源[41]。

4 結論

(1)該海區各營養類型的浮游原生生物生長均受P 的限制，P的添加會促進各營養類型浮游原生生物的生長，特別是培養早期對自養型原生生物的促進作用最為顯著。

(2)沙塵在培養早期對自養型為促進作用，對異養和兼養型為抑制作用；沙塵對10～20 μm自養原生生物生長速率促進作用最強，對5～10 μm異養原生生物和10～20 μm兼養型原生生物生長速率抑制作用最強。沙塵對原生生物生長的促進作用可能與沙塵中P 的溶出有關。

(3)沙沉在培養后期對自養型原生生物的生長為抑制作用，對異養和兼養型為促進制作用，其作用強度為異養>兼養型，對小粒徑的異養和兼養型原生生物生長速率促進作用最強，影響也更加持久。沙塵對不同粒徑級和營養類型浮游原生生物生長速率的影響，會改變黃海南部海區微型食物網的結構，進而對該海區微食物環在物質轉化和食物產出中的生態功能產生影響。