無柄靈芝子實體的化學成分研究

劉文星，楊橋芬，葉艷青

(云南民族大學 化學與環境學院，云南 昆明 650500)

靈芝Ganodermalucidum屬于真菌門靈芝菌科靈芝屬[1]，它具有補氣安神、止咳平喘的功效，能治療肺虛咳喘、心神不寧、失眠心悸、虛勞短氣、不思飲食[2].靈芝含有三萜類、多糖、蛋白質、有機酸、氨基酸等各種成分，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫等作用[2].靈芝的同屬真菌無柄靈芝Ganodermaresinaceum可預防和治療各類疾病，具有抗癌、保肝、增強免疫力等多種作用，它的化學成分復雜，主要有三萜、降三萜、雜萜、黃酮、甾體、多糖、喹諾酮、葡聚糖、混源萜等成分[3-11].本研究從無柄靈芝實體中得到了6個化合物，它們分別為lucidone I(1)、spiroapplanatumine L(2)、spiroapplanatumine M(3)、牛蒡苷(4)、applanatin A(5)和3-羧基吲哚(6)(見圖1)，所有化合物均為首次從該真菌中分離得到.

圖1 化合物1～6的結構

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent-1200 型HPLC(Agilent)；DRX-400 型核磁共振儀(Bruker)；Venusil XBP-C18(10 mm×250 mm，5 μm)半制備色譜柱(美國 BIO-RAD)；YMC-Pack ODS-A(20 mm×250 mm，S-5 μm)制備色譜柱(美國BIO-RAD)；OSB-2100BS型旋轉蒸發儀(日本EYELA).

1.2 材 料

200～300目硅膠(青島海洋化工)；GF 254(50×100 mm)薄層色譜板(青島海洋化工)；MCI-gel CHP-20P(75～150 μm)樹脂(南京元寶峰醫藥科技)；10% H2SO4；分析純乙腈、甲醇(天津天泰精細化學品有限公司)；工業級甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯；超純水.

本實驗所用的無柄靈芝G.resinaceum子實體原產地為云南瑞麗，2017年4月從昆明市菊花村藥材交易市場購買，樣品鑒定人：云南民族大學楊青松副教授.

2 提取分離

45 kg 的無柄靈芝G.resinaceum干燥后粉碎，用95%的乙醇加熱回流提取2次，濃縮后用乙酸乙酯萃取，濃縮得到 1.0 kg 浸膏.浸膏用正相硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷∶甲醇(V/V)進行梯度洗脫(1∶0、70∶1、80∶2、80∶10、10∶2、0∶1)，得到6個(A～F)組分.

組分C(500.0 g)用正相硅膠柱層析分離，用二氯甲烷:甲醇梯度洗脫(1∶0、80∶2、100∶5、100∶10、100∶20、0∶1)，得到6個組分(C-1～C-6).用MCI柱層析分離C-3(48.9 g)，以體積分數32%、45%、60%、75%、95%的甲醇水洗脫劑來洗脫，然后用HPLC分離得到化合物2(4.0 mg)、5(21.0 mg)和化合物6(56.7 mg).

組分D(300.0 g)以二氯甲烷∶甲醇為洗脫劑(1∶0、70∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，用正相硅膠柱層析梯度分離得到7個組分(D-1～D-7).D-2(62.5 g)用甲醇水作為洗脫劑，用反相柱色譜梯度洗脫，再用HPLC分離得到化合物1(80.0 mg).D-3(63.8 g)進行反相柱層析，用甲醇-水(體積分數為20%、30%、50%、70%、90%)洗脫，再用HPLC分離得到化合物3(52.2 mg)和化合物4(7.8 mg).

3 結構鑒定

化合物1黃色粉末，根據NMR數據推斷其分子式為C24H34O4，不飽和度Ω = 8.1H NMR (Pyridin-d5,400 MHz)δ:2.89 (1H, m, H-1a), 1.29 (1H,m,H-1b),1.85～1.95(2H,m,H-2),3.41(1H,dd,J=5.1,11.0 Hz,H-3),1.85-1.95 (1H,m,H-5),2.68(1H,m,H-6a),2.37(1H,m,H-6b),3.10(1H,d,J=15.7 Hz,H-12a),2.82(1H, d,J=15.7 Hz,H-12b),2.89(1H,m,H-16a),1.53(1H,d,J=7.1 Hz,H-16b),2.34(1H,m,H-17),0.95(3H,s,H-18),1.34(3H,s,H-19),2.39(1H,m,H-20), 1.05 (3H, t-like,J= 5.7 Hz,H-21),1.12 (3H,s,H-28),1.03(3H,s,H-29),1.73(3H,s,H-30);13C NMR (Pyridin-d5,100 MHz)δ: 34.5(C-1),28.5(C-2),77.0(C-3),40.0(C-4),52.0(C-5),37.2 (C-6), 200.1(C-7),147.4(C-8),152.1(C-9),41.3(C-10),200.5(C-11),50.1(C-12),45.6(C-13),58.0(C-14),208.0(C-15),40.7(C-16),44.9(C-17),16.5(C-18),18.3(C-19),32.2(C-20),20.3(C-21),28.5(C-28),16.5(C-29),21.8(C-30).以上數據與文獻[11]報道一致，鑒定化合物1為lucidone I.

化合物2黃色膠狀物，根據NMR數據推斷其分子式為C16H16O6，不飽和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.89 (1H, d,J= 2.6 Hz, H-3), 7.13 (1H, dd,J= 8.9, 2.6 Hz, H-5), 6.94 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-6), 3.29 (1H, d-like,J= 9.5 Hz, H-3′), 2.04～2.13 (4H, m, H-4′, H-5′), 3.00 (1H, dd,J= 6.6, 16.1 Hz, H-6′), 5.07 (1H, s, H-8′a), 5.07 (1H, s, H-8′b), 3.80 (2H, s, H-9′);13C NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 167.2 (C-1),123.3(C-2),107.9(C-3),153.7 (C-4), 128.1 (C-5),114.6 (C-6),205.1 (C-1′), 98.7 (C-2′), 53.9 (C-3′), 28.7(C-4′),30.7(C-5′),53.9(C-6′),146.2(C-7′),113.2(C-8′),65.4 (C-9′), 176.2(C-10′).以上數據與文獻[12]對照一致，鑒定化合物2為spiroapplanatumine L.

化合物3黃色膠狀物，根據NMR數據推斷其分子式為C16H16O6，不飽和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.86 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-3),7.12(1H,dd,J=8.9,2.7 Hz,H-5),6.92 (1H, d,J=8.9 Hz,H-6),3.29(1H, t-like,J=5.0 Hz,H-3′),2.02～2.14(4H,m,H-4′,H-5′),2.92(1H,dd,J=7.9,10.2 Hz,H-6′),5.05(1H,s,H-8′a), 5.05(1H,s,H-8′b),3.77(2H,s,H-9′);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:167.2(C-1), 123.0(C-2),107.8(C-3),153.8(C-4),128.4(C-5),114.6(C-6),204.5(C-1′),98.2(C-2′),56.1(C-3′),27.8(C-4′),30.5(C-5′),53.9(C-6′),145.8(C-7′),113.5(C-8′),65.4(C-9′),174.4(C-10′).以上數據與文獻[12]對照一致，鑒定化合物3為spiroapplanatumine M.

化合物4白色粉末，根據NMR數據推斷其分子式為C27H34O11，不飽和度Ω = 11.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.73(1H, d,J=1.7 Hz,H-2), 7.05 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5),6.63(1H, dd,J= 1.6, 8.3 Hz, H-6),2.87 (2H, m, H-7),2.65 (1H, dd,J= 7.4, 13.2 Hz, H-8),6.57-6.68(1H, m, H-2′), 6.80 (1H, d,J= 8.6 Hz,H-5′), 6.58 (1H, d,J= 6.2 Hz, H-6′),2.63-2.68(1H, dd,J=7.4,13.2 Hz, H-7′a),2.50～2.54(1H, m, H-7′b),2.46(1H, dd,J= 7.7, 14.5 Hz, H-8′), 4.16 (1H, dd,J= 7.6, 8.6 Hz, H-9′a), 3.88 (1H, m, H-9′b), 4.87 (1H, s, glu), 3.66～3.92 (10H, m, glu), 3.77, 3.77, 3.73 (9H, s, OMe);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ: 134.2 (C-1),113.5 (C-2),150.5 (C-3),149.1 (C-4),117.7 (C-5),122.0 (C-6), 33.3 (C-7), 45.6 (C-8), 181.3 (C-9), 132.6 (C-1′), 114.7 (C-2′), 150.4 (C-3′), 146.7 (C-4′), 112.8 (C-5′), 122.9 (C-6′),36.7 (C-7′), 40.4 (C-8′), 72.9 (C-9′), 102.8 (C-1″), 74.8 (C-2″), 77.7 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.1 (C-5″), 62.4 (C-6″), 56.8, 56.5, 56.4 (OMe).以上數據與文獻[13]對照一致，鑒定化合物4為牛蒡苷(arctiin).

化合物5無定型粉末，根據NMR數據推斷其分子式為C16H16O6，不飽和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 3.16 (1H, brs-like, H-2), 6.75 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-5), 7.00 (1H, dd,J= 8.7, 1.8 Hz, H-7), 6.80 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-8), 1.94 (2H, m, H-10), 1.92 (1H, m, H-11), 2.83 (1H, m, H-12), 4.90 (1H, m, H-15a), 4.82 (1H, m, H-15b), 3.66 (1H, s, H-16);13C NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 98.6 (C-1), 57.3 (C-2), 204.7 (C-3), 123.1 (C-4), 107.9 (C-5), 167.1 (C-6), 128.2 (C-7), 114.6 (C-8), 153.6 (C-9), 28.1 (C-10), 30.6 (C-11), 53.8 (C-12), 204.9 (C-13), 146.0 (C-14), 113.3 (C-15), 65.4 (C-16).以上數據與文獻[14]對照一致，鑒定化合物5為applanatin A.

化合物6黃綠色結晶，根據NMR數據推斷其分子式為C9H7NO2，不飽和度Ω = 7.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 7.92 (1H, s, H-2), 8.04 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-5), 7.16 (2H, m, H-6, H-7), 7.41 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-8);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ: 133.4 (C-2), 127.5 (C-3), 108.9 (C-4), 123.6 (C-5), 122.0 (C-6), 122.4 (C-7), 112.9 (C-8), 138.2 (C-9), 169.3 (C-10).以上數據與文獻[15]對照一致，鑒定化合物6為3-羧基吲哚(1H-indole-3-carbaldehyde).

4 結語

本實驗對無柄靈芝G.resinaceum子實體的95%乙醇提取物通過正相柱色譜、反相柱色譜、MCI柱色譜以及半制備HPLC等技術手段進行了化學成分研究，得到了6個化合物(lucidone I(1)、spiroapplanatumine L(2)、spiroapplanatumine M(3)、牛蒡苷(4)、applanatin A(5)和3-羧基吲哚(6))，它們的結構通過核磁共振技術(1H NMR、13C NMR)進行了鑒定，所有化合物均為首次從該大型真菌中分離得到.本研究為進一步開發無柄靈芝提供了物質基礎和有益的借鑒.