再生性牙髓治療的臨床和組織學結果的描述性系統評價

陳 霞，汪成林，葉 玲

再生性牙髓治療(regenerative endodontic procedures，REPs)屬于組織工程范疇，被定義為以生物為基礎的治療方法，旨在修復或替換受損組織，包括牙本質和牙根結構以及牙髓-牙本質復合體的細胞[1]。它是由Ostby[2]于1961年首次使用，由Iwaya等[3]修訂，并由Murray等[1]正式命名。從報道的病例看，牙髓壞死或伴有根尖周炎的年輕恒牙經REPs后，臨床結果往往較好，只有少數病例失敗[4-5]。為規范治療效果評價，美國牙髓病學協會(American Association of Endodontists，AAE)針對REPs先后提出4個版本的臨床指南，目前已更新到2018年4月的版本，其中將治療效果評價分成三級：初級目標為臨床癥狀消失及骨修復；二級目標為根管壁厚度增加和/或牙根長度增加；三級目標為牙髓活力測試陽性。目前報道成功的病例大多數達到初級或二級目標，少數達到三級目標，臨床表現評價分別為患牙的臨床癥狀消失，根尖周病變愈合；牙根繼續發育包括根管壁增厚、牙根增長、根尖孔縮小[6-9]；甚至有部分患牙恢復牙髓活力，臨床檢查表現為牙髓電活力測試(electric pulp testing，EPT)陽性[10-12]。

目前已知根管治療后根尖周組織的愈合方式有5種：①由新生牙骨質或骨樣組織使根尖孔封閉；②根尖孔處有瘢痕組織形成；③健康的纖維結締組織或骨髓狀的疏松結締組織充滿根尖區；④根管超充填者，由纖維組織囊包圍；⑤牙槽骨增生與根尖部相連而成骨性愈合，5種愈合方式均為組織學檢查結果，因此REPs的治愈效果還欠缺組織學層面的評價。REPs動物模型的組織學檢查顯示，根管壁上新形成的硬組織為牙骨質樣[13-15]、骨樣[15]和牙本質樣組織[16]，根管內形成的軟組織為牙周膜樣組織[14-15]，甚至為含成牙本質細胞層的牙髓樣組織[16]。由于嚴格的倫理限制和多重考慮，人的年輕恒牙經REPs后的組織學檢查病例十分有限，但卻為后續研究提供了重要證據。本研究的目的是在有限的病例報道中，對年輕恒牙經REPs后的臨床結果包括臨床檢查和影像學檢查與組織學結果做一描述性系統評價。

1 資料與方法

1.1 納入和排除標準

本系統評價的納入標準是英語的、人的、有REPs的年輕恒牙，有臨床檢查結果和對根尖軟硬組織有組織學評價的研究，排除標準是其他語言的、動物的、細胞的和對成熟恒牙的或對年輕恒牙但沒有臨床檢查和組織學檢查的人的研究。

1.2 文獻檢索

在MEDLINE和Web of Science數據庫進行電子檢索，采用以下關鍵詞：

(histological OR histology) and (revascularization OR regenerative endodontics OR regeneration OR regenerative endodontic treatment OR regenerative endodontic procedure) and (immature teeth OR open apex)。檢索文獻起自1965年，2019年12月31日前完成最后一次檢索。

1.3 文獻篩選

所有文章的標題和摘要先后由兩位作者獨立篩選后相互核對，不符合納入標準的被排除，然后對剩下的文章進行全文評價，如有異議，將由第三作者決定是否被納入。

1.4 數據提取和文獻質量評價

提取文獻中的作者、年份、患者年齡和性別、術前診斷、治療過程、拔牙原因和時間、臨床結果和組織學檢查結果等。對納入的病例研究采用英國國家優化衛生與保健研究所(National Institute for Health and Care Excellence，NICE)推薦的病例系列評價量表進行質量評價。

1.5 結果合成

由于納入的研究均為病例報道，無隨機對照試驗，治療過程、臨床檢查和以及組織學檢查結果方法差異大，異質性大，難以使用定量的Meta分析，故本文只進行定性的系統評價。

2 結 果

2.1 檢索結果

通過兩個數據庫的電子檢索，一共搜索到265篇文章，通過兩位作者的篩選，首先排除動物研究72篇，排除回顧性研究37篇，對剩下的研究里排除細胞研究和成熟恒牙的研究及年輕恒牙但沒有組織學檢查的研究140篇，最終有16篇文章達到了納入標準[11-12,17-30]，這些研究均進行了詳細的組織學分析，7篇文章還包括免疫組織化學分析。

2.2 文獻質量評價

本文納入的16篇文獻采用NICE推薦的病例系列評價量表進行質量評價，包括以下內容：①案例是否源于多個治療中心；②研究目標是否描述清晰；③納入標準和排除標準是否描述清晰；④對報道的結果的定義是否明確；⑤是否進行前瞻性研究；⑥患者是否被連續招募；⑦主要發現是否清晰描述；⑧是否對結果進行分層分析。每項作出“是”或“否”的判定，分別計1或0分，然后合計評分?？偡譃?8 分，8 ～ 4 分為高質量，4 分以下為低質量。 本文最終1個3分，14個4分，1個5分，即15篇高質量文獻，1篇低質量文獻。

2.3 納入研究的基本特征

2.3.1 性別 本文納入的25顆患牙中，患者性別分別為，11男，13女、1未知，經REPs后，治療失敗的2位患者[22,28]性別為1男[22]、1女[28]。

2.3.2 牙位和年齡 本文納入的25顆牙中，包含了9顆切牙、15前磨牙和1磨牙。這些病例中，1位患者年齡未知，1位患者年齡為29歲，其余23位患者年齡在6～13歲。一般來說，上頜中切牙在7～8歲萌出，上頜側切牙在8～9歲萌出，上頜第一前磨牙在10～11歲萌出，上頜第二前磨牙在10～12歲萌出，下頜第二前磨牙在11～12歲萌出，第一磨牙在6～7歲萌出。因此，納入的25顆牙中，除1位患者年齡未知，1顆牙[27]在萌出10年以上才接受治療，其余牙都是在萌出后3年內接受治療。

2.4 治療結果

2.4.1 臨床結果和影像學結果 本文納入的25顆牙中，2顆牙[22,28]失敗，根尖周病變持續存在、未見明顯的牙根繼續發育，即未達到AAE評價的初級目標；2顆達到初級目標[17,28]，即臨床癥狀消失、根尖周病變愈合；16顆牙在初級目標的基礎上達到二級目標[18-19,21,23-30]，可見牙根繼續發育；5顆牙在二級目標的基礎上達到三級目標[11-12,20,29-30]，能檢測到牙髓活力。

2.4.2 組織學結果 本文納入的所有病例均進行了組織學檢查，7篇文獻[11-12,17-18,23,28,30]包括10顆牙還進行了免疫組織化學檢查，2篇文獻[22,28]包括4顆牙進行了細菌染色。

臨床失敗的2顆牙[22,28]其失敗原因和肉芽腫組織存在及感染未徹底控制有關，其中1顆牙[28]的組織學檢查發現根尖段根管壁上仍有硬組織沉積，根管內可見修復性結締組織，根尖可見肉芽腫，但其革蘭染色未發現細菌；而另1顆患牙[22]可見牙根外吸收，部分吸收區見骨樣或牙骨質樣組織沉積，根管內可見炎癥細胞、壞死碎片和細菌生物膜。

達到AAE評價初級目標的2顆牙中，1顆牙[17]根管內可見修復性結締組織且無炎性細胞，未見感染且有成牙本質細胞層，卻未見牙硬組織形成，可能與其觀察時間僅達3.5周有關，考慮到AAE建議REPs術后的觀察時間為6個月以上，后續未對該病例進行分析。另1顆牙[28]根管內為無成牙本質細胞的結締組織，但其免疫組織化學檢查發現根管內軟組織神經絲(neurofilament，NF)+(較正常牙少)。

達到AAE評價二級目標的16顆牙中，1顆牙[25]的根尖段可見新的牙本質樣組織形成且根尖段可見成牙本質細胞；1顆牙[23]作者認為有第三期牙本質形成，免疫組織化學顯示骨鈣素(osteocalcin，OCN)+，根管內軟組織NF+，但無牙本質細胞形成；剩余14顆牙[18-19, 21, 24, 26-30]新形成的組織為牙骨質樣或骨樣組織，軟組織也缺乏成牙本質細胞，大多數根管內可見營養不良性鈣化，其中有3顆牙做了免疫組織化學染色，分別顯示骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)+、牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)-、NF-[18]和Ⅲ類b-微管蛋白(class Ⅲ b-tubulin，TUBB3)+、施萬細胞的標志物(S100)+(與痛覺感受器標志物降鈣素生成肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)不能實現共定位)、OCN+、DSP-[30]以及根尖乳頭NF+[28]。

達到AAE評價三級目標的5顆牙中，有2顆牙僅有軟組織的組織學檢查，其中1顆牙[12]與正常牙髓相似，可見成牙本質細胞，且其免疫組織化學顯示神經元標志物(neuronal marker，NeuN)+，1顆牙[20]則為缺少典型的成牙本質細胞層的結締組織；另外3顆包括硬組織和軟組織的組織學檢查中，僅1顆牙[30]有新的牙本質和成牙本質細胞形成，其免疫化學組織檢查顯示TUBB3+、S100+、新形成硬組織OCN+、DSP+，其余2顆牙[11,29]根管壁上新形成的為牙骨質樣組織，根管內無成牙本質細胞形成，其中1顆牙[11]做了免疫組織化學檢查，顯示神經纖維標志物蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5，PGP9.5)+、成牙本質細胞標志物巢蛋白(nestin)-。

3 討 論

為全面分析評價年輕恒牙REPs的治療結果，包括臨床結果(包括影像學結果)和組織學結果，本文通過文獻的納入和排除，總共有16篇文獻納入研究。納入的研究均為病例報道研究，無隨機對照研究，治療結果會有較大的誤差；另外，本文僅選擇已發表于有限的數據庫中的英文文獻，存在著一定的發表偏倚。16篇文獻里，共計25顆牙納入，其中有1顆牙因觀察時間太短僅3.5周，治療結果難以評價，故不納入后續討論。

3.1 牙根繼續發育的組織學特征

本文納入分析的24顆牙中，共有21顆牙的影像學檢查表現出牙根繼續發育，即達到AAE評價的二級目標或三級目標。然而組織學檢查發現，僅2顆牙[25, 30]有新的含牙本質小管的牙本質樣組織形成和排列整齊的成牙本質細胞層形成；另外1顆牙[12]也有成牙本質細胞層形成，但由于該患者未拔牙，只有軟組織的組織學檢查結果。剩余18顆牙均無成牙本質細胞層和牙本質樣組織形成，其中有17顆牙的根管壁沉積的組織為牙骨質樣和骨樣組織，且牙骨質樣組織較為多見，另外1顆牙[23]其作者認為是有第三期牙本質形成，但其免疫組織化學僅顯示OCN+，未行DSP染色，考慮到牙骨質和骨組織均表現為OCN+，無法確定新形成的硬組織為牙本質。從目前的結果看，導致患牙在影像學表現為牙根繼續發育的原因是牙本質、牙骨質和骨樣組織的沉積，其中多為牙骨質樣和骨樣組織沉積，而較少發生的牙本質樣組織形成往往伴隨成牙本質細胞層的形成[25, 30]。該部分結果提示，REPs的術后愈合機制大部分與根管治療后根尖周組織的愈合機制相似，僅少數病例有新生牙本質形成。

3.2 牙髓活力測試陽性的組織學特征

本文納入分析的24顆牙中，有5顆牙[11-12,20,29-30]達到三級目標，牙髓活力測試陽性，其中3顆牙[11-12,30]的免疫組織化學檢查結果分別顯示PGP9.5+、NeuN+以及TUBB3+和S100+，均表明有神經再生，另外2顆牙未行免疫組織化學檢查。除了這5顆牙之外，還有3顆牙[23,28,30]僅達到AAE評價的二級目標(1顆牙髓活力測試陰性，2顆未行牙髓活力測試)，但免疫組織化學檢查顯示可能有神經再生，表現為根管內軟組織NF+[28]、牙髓樣組織NF+[23]、TUBB3和S100+(但與CGRP不能實現共定位)[30]。由此可見，達到AAE評價的三級目標的患牙，其組織學檢查往往能發現神經再生，而達到二級目標的部分患牙，組織學檢查仍可發現神經再生?？紤]到牙髓電活力測試是評估牙髓中的Aδ神經纖維的完整性，它與牙釉質和牙本質的厚度以及牙髓中神經纖維的數量有關[31]。而在REPs中，再生牙髓樣組織常位于釉牙骨質界的根方，其上方又常有較厚的生物蓋髓材料和充填材料覆蓋，牙髓電活力測試存在出現假陰性結果的可能。從目前的結果看，即使AAE評價結果為二級的病例，其組織學上也可能有神經再生，因無法利用組織學檢查判斷是否有神經再生，其檢測方式仍有待改善。有研究[32]采用多普勒血流儀來判斷牙髓組織是否有血管再生，結果發現伴隨牙髓活力測試陽性的恢復，血流量也有所恢復，提示血流量的檢測可以作為判斷牙髓活力狀態的補充，但同樣存在假陰性結果的可能。

3.3 牙髓、根尖周組織的術前狀態對結果的影響

本文納入分析的24顆牙，其牙髓、根尖周組織的術前狀態各異，其中8顆[24,29]牙完全健康；4顆牙[25,28]牙髓部分壞死但根尖周有病變；1顆牙[19]的近中根牙髓部分壞死，遠中根牙髓壞死；10顆牙[11,18,20-23,26,27,30]牙髓壞死且伴有根尖周低密度影,1顆[12]未知。

活髓且根尖周健康的患牙即8顆完全健康的牙中，7顆[24,29]達二級目標，1顆[29]達三級目標，且8顆牙的組織學檢查均未發現牙本質和成牙本質細胞形成；除1顆未知外，其余15顆牙牙髓根尖周有病變的患牙中，2顆牙[22,28]治療失??；1顆[28]達初級目標；9顆牙達二級目標且其中2顆[23,30]免疫組織化學檢查有神經再生、1顆[25]根尖段見新的牙本質樣組織和成牙本質細胞形成；3顆牙[11,20,30]達三級目標且其中1顆[30]組織學檢查發現牙本質樣組織和成牙本質細胞形成。

從上述結果看，兩種術前狀態(健康牙髓和牙髓壞死根尖周病變)均可獲得組織學上的牙本質或牙髓的再生，但根尖周有病變的患牙更容易出現治療失敗的情況。細胞歸巢被定義為在生物信號分子的作用下，招募內源性干細胞或祖細胞至某個結構內，以達到組織的修復或再生[33]。REPs中，細胞歸巢主要是招募內源性細胞包括干細胞/祖細胞到根管內[34]，這些細胞包括根尖乳頭細胞干細胞[35-36]、牙髓干細胞[37-38]、骨髓間充質干細胞[39]。因此，根尖周即使存在病變也可獲得組織學上的再生，可能與根尖周組織的存活細胞或血液來源的干細胞有關，而感染程度并非決定性因素。

3.4 治療過程對結果的影響

3.4.1 次氯酸鈉沖洗液 24顆牙中除1顆[12]未知，剩余23顆牙使用的沖洗液為1.00%～5.25%的次氯酸鈉(sodium hypochlorite，NaClO)溶液，使用低濃度1.0%～1.5% NaClO溶液的12顆牙中，達到初級、二級、三級目標的牙數分別為1顆、9顆、2顆，所有牙均無牙本質和成牙本質細胞形成，包括2顆牙顯示有神經再生。使用中等濃度2.5%～3.0% NaClO溶液的5顆牙中，失敗1顆，達二級目標4顆，均無牙本質和成牙本質細胞形成。使用高濃度5.25% NaClO溶液的6顆牙中，失敗1顆，達二級、三級目標的牙數分別為3顆、2顆，其中有2顆組織學評價見牙本質樣組織和成牙本質細胞層形成。

從臨床結果看，使用不同濃度的NaClO溶液沖洗根管對治療效果可能影響較小。但從組織學結果看，似乎高濃度處理更容易形成牙本質細胞和牙本質樣組織。這和AAE操作指南上建議使用1.5%濃度NaClO進行沖洗的建議有出入，考慮到高濃度NaClO主要表現為組織溶解性和滅菌性能，及其對根尖周組織的毒性[40]，如能有效控制感染，高濃度NaClO的使用對于最終臨床結果并非必要。

3.4.2 EDTA沖洗液 REPs最后一次使用的沖洗液多為17%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，有17顆牙[11,23-24,26-30]，其次為生理鹽水或NaClO溶液有6顆[18-22,25]。使用17%EDTA溶液沖洗的17顆牙中，失敗1顆，達初級、二級、三級目標的牙數分別為1顆、12顆、3顆，其中有3顆牙[23,28,30]免疫組織化學檢查顯示神經再生，1顆牙[30]見牙本質樣組織和成牙本質細胞。使用其他沖洗液的6顆牙，失敗1顆，達二級目標4顆，達三級目標1顆，其中1顆牙[25]可見牙本質樣組織和成牙本質細胞。

有研究顯示，高濃度的NaClO溶液和三聯抗生素糊劑(triple antibiotic paste，TAP)對根尖周干細胞的生存、增殖和分化有一定抑制作用[41-42]，而17% EDTA可減少NaClO的毒性[40]，并且17% EDTA使用，尤其與NaClO溶液配合使用時[43]，能促進牙本質內的生長因子釋放，同時17% EDTA可促進牙髓干細胞對牙本質的粘附、遷移和分化能力[44-45]。因此，盡管從臨床結果和組織學結果看，刺激根尖出血前是否使用17%EDTA溶液沖洗影響有限，但AAE操作指南仍然建議在引血前用17%EDTA沖洗根管。

3.4.3 診間封藥

除了有8顆[24,29]完全健康的牙一次性完成REPs而未用診間封藥、1顆[12]未知外，7顆牙采用氫氧化鈣糊劑[18,22,27-28,30]，8顆牙采用TAP/二聯抗生素糊劑(double antibiotic paste，DAP)[11,19-21,23,25-26,30]。使用氫氧化鈣診間封藥的7顆牙中，失敗2顆，達初級目標1顆，達二級目標4顆，其中2顆組織化學染色可見神經再生。使用TAP/DAP的8顆牙中，達二級目標5顆，達三級目標3顆，其中1顆染色見神經再生，2顆見牙本質樣組織和成牙本質細胞。

從臨床結果和組織學結果看，似乎TAP/DAP診間封藥擁有更高的成功率和更好的治療效果，這可能與TAP/DAP抗感染能力更強有關[46]。

3.4.4 干細胞和支架 技術方面，僅Xuan等[12]采用自體牙髓干細胞移植、血凝塊為支架的方法而達三級目標且有與正常牙髓組織相似的含成牙本質細胞樣組織形成外，其余23顆牙均采用誘導根尖周干細胞遷移或根尖殘髓增殖分化的方法。采用單純血凝塊為支架的患牙有14顆牙[11-12,17-18,21-24,26,28-30]，采用復合血凝塊(膠原+羥基磷灰石+血凝塊)的有4顆牙[29]，而采用富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)的患牙僅2例[20,27]，1例[19]的近中根使用血凝塊而遠中根使用血凝塊和PRP，而未能刺激根尖出血而無支架有2顆牙[25,30]。

以血凝塊為支架的14顆牙中，失敗2顆，達初級、二級、三級目標的牙數分別為1、8、3顆。達二級目標的8顆牙均無成牙本質細胞和牙本質樣組織形成；達三級目標的 2顆牙組織染色均顯示有神經再生，且有1顆牙根管內可見成牙本質細胞和牙本質樣組織形成。

使用膠原-羥基磷灰石+血凝塊的4顆牙[29]，均為完全健康的牙，其根管消毒方法和支架置入方法都完全一樣，臨床結果卻不一樣，有1顆牙牙髓活力測試陽性，達到三級目標，另外3顆牙達二級目標；但4顆牙的組織學結果均相似，即根管內軟組織為無炎癥的、不含成牙本質細胞的疏松結締組織，沉積硬組織為牙骨質樣組織。

使用PRP、PRF的2顆牙中，1顆[20]達三級目標，組織學檢查僅對軟組織進行了評價，未發現成牙本質細胞樣細胞形成；而另1顆[27]達二級目標，組織學檢查僅對硬組織進行了評價，顯示僅有細胞樣牙骨質沉積。

無支架的2顆牙經REPs后，均達二級目標，但組織學檢查發現，其中1顆牙[25]見典型的牙本質樣組織和成牙本質細胞樣細胞形成；另1顆牙[30]發現骨樣組織沉積、無成牙本質細胞樣細胞形成，免疫組織化學檢查發現有神經標志物的形成。

有趣的是，有作者在同1顆牙(46牙)[19]分別在近中根使用血凝塊、遠中根使用PRP，其余處理條件完全一樣，最終獲得的臨床結果和組織學結果沒有差別，表現為根尖周病變均愈合，根管壁沉積硬組織均為牙骨質樣組織，軟組織均為結締組織且未發現成牙本質細胞。

研究顯示，血凝塊、PRP、PRF均能釋放生長因子，促進干細胞的增殖、遷移和分化[47]，從目前僅有的結果看，這些方法對臨床和組織結果影響不大，均被AAE建議。

3.5 隨訪時間

AAE建議患者術后6、12、24個月隨訪，通常在前兩次就診期間臨床癥狀消失，6～12個月后可發現根尖周病變愈合，12～24個月后可觀察到牙根繼續發育。因此，短期時間內，牙根繼續發育不明顯，例如本文納入的1顆牙[17]，僅有3.5周隨訪時間，雖然沒有硬組織形成，但其根管內可見排列整齊的成牙本質細胞層，若隨訪時間延長，可能會有牙本質或其他硬組織形成。同時，短期隨訪時間也可能會有一些癥狀不會表現出來，例如治療失敗的這顆牙[22]，12個月都未出現癥狀，根尖周也未見明顯病變。

從本文納入的研究看，對于根尖周發生病變的病例，最早出現初級目標的是1個月[21,27,30]，最早出現二級目標的是3個月[25,29]，最早達到三級目標的是5個月[30]。因此，建議患者在術后1和3個月也要隨訪觀察，同時在第二次隨訪(3個月)開始檢查患牙牙髓活力情況。

3.6 患牙萌出后時間

年輕恒牙是指根尖未完全發育完整的年輕或新萌出恒牙，一般恒牙萌出后需要經歷3年或更長時間才能使牙根發育完全[48]。年輕恒牙在發育過程中易受到創傷、齲壞以及發育異常的影響，使牙根停止發育，其治療時間則可能超過萌出后的牙根形成的關鍵時期。在治療時間遠遠超過年輕恒牙萌出3年的病例當中，有患者20歲[49]、44歲[50]時仍獲得了REPs的成功，所以治療時患牙萌出后時間或許并不是一個決定性因素，而只是個影響因素。本文納入的25顆牙中，除1例患者年齡未知，1顆牙[27]在萌出10年以上才接受治療，其余牙都是在萌出后3年內接受治療。結合臨床結果和組織學結果看，達三級目標或免疫組織化學顯示神經再生的患牙為2顆[28,30]中切牙(6歲和8歲)、1顆[20]上頜前磨牙(11歲)和4顆下頜第二前磨牙(3顆10歲、1顆12歲)，顯示有牙本質和成牙本質細胞層的患牙為2顆[25,30]下頜第二前磨牙(10歲和11歲)，這些牙均在萌出后1年內接受治療。而唯一的1例29歲患者，經REPs后達二級目標，組織學檢查無牙本質樣組織和成牙本質細胞形成，硬組織為有細胞牙骨質樣組織。目前的結果提示越早接受治療有利于更佳的臨床及組織學效果，而成年后行REPs也并非禁忌證。

4 小 結

年輕恒牙經REPs后，往往能取得臨床上的成功，牙根繼續發育的實質多為牙骨質樣和骨樣組織沉積，少數為牙本質的形成，而有牙本質的形成則往往伴有成牙本質細胞的形成；同時，牙髓活力的恢復往往伴有神經的再生。而目前的研究均為少量病例報道，今后仍需前瞻性隊列研究，以便對不同的術前狀態、不同的消毒方案、不同的細胞技術及支架的影響進行評價，調整治療方案以達到牙髓-牙本質復合體真正意義的再生。