迪慶藏豬FUT1 基因遺傳變異分析

方 晨 ，胡瑞舉，楊明華，張 斌，劉韶娜，郭 飛，黃 英，趙彥光*，趙素梅*

（1.云南農業大學云南省動物營養與飼料重點實驗室，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明 650224）

斷奶仔豬腹瀉是由多種因素引起的急性、致死性傳染病。腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）F18 通過黏附于仔豬小腸黏膜上皮細胞的受體蛋白釋放腸毒素，引起仔豬斷奶前后腹瀉和水腫[1]。α（1，2）巖藻糖轉移酶基因1（α-1，2-Fucosyltransferase gene，FUT1）是調節大腸桿菌F18 黏附受體表達的一個候選基因，影響仔豬的腹瀉和水腫，位于豬6 號染色體的6q11 區段[2]。相關研究表明，FUT1基因與豬的產仔性能、發育性狀和腹瀉相關[3-9]。

迪慶藏豬是云南省優良的地方品種，位于高原嚴寒地區，具有耐寒、抗逆性強、肉質優良等特點[10-11]。本實驗以迪慶藏豬仔豬為研究對象，采用測序方法檢測FUT1基因，并研究分析FUT1基因編碼蛋白，為建立地方豬種抗病育種的候選基因及相關遺傳標記和分子育種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗于云南省畜牧獸醫科學院養豬與動物營養研究所豬場進行，選取113 頭35 日齡體重8 kg左右的迪慶藏豬斷奶仔豬。

1.2 樣品采集 實驗豬出生后一天內采集耳組織，并放入裝有酒精的2 mL 離心管中，-80℃冰箱保存。

1.3 基因組DNA 提取 參照試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書提取DNA。采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，核酸濃度檢測儀測定基因組DNA濃度，并稀釋到50 ng/μL，-20℃保存備用。

1.4 引物設計及合成 根據豬FUT1基因全序列（GenBank登錄號：NC_010448.4），用Primer3 在線軟件（http://primer3.ut.ee/）設計引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

1.5 PCR 擴增及測序 PCR 擴增反應體系20 μL：Template（10×）2 μL，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（10 mmol/L）12.5 μL（擎科生物有限公司），ddH2O 3.5 μL。PCR 產物由通用生物公司測序，FUT1基因PCR 反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，40 個循環，72℃后延伸7 min 。

表1 FUT1 基因分段擴增引物

1.6 生物信息學分析 將PCR 擴增的FUT1基因6 段序列進行拼接。應用DNAMAN8.0 軟件翻譯FUT1基因序列，分析氨基酸突變。使用在線軟件ProParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）進行蛋白質理化性質分析；使用ProtScale 程序（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白疏水性；使用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白跨膜分析；使用NetPhot（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白磷酸化位點；使用NetNGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析蛋白糖基化位點；使用SignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）分析蛋白信號肽；使用PSIPED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測蛋白二級結構；使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白結構域；使用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）預測蛋白三級結構。

1.7 統計分析 使用DNAstar 軟件比對序列，DNAMAN軟件進行同源性分析，MEGA8.0 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 的PCR 擴增產物檢測 PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。FUT1基因擴增產物條帶單一、清晰明亮，與預期片段大小相符，符合DNA 測序的要求（圖1）。

2.2 氨基酸變異分析 將6 段測序序列拼接，得到FUT1基因全長3 045 bp。通過比對迪慶藏豬FUT1 氨基酸變異位點與豬FUT1基因全序列（GenBank 登錄號：NC_010448.4），發現FUT1基因有7 個突變位點，其中C299T、C862G、C2418A、A306G 這4 個位點為錯義突變（圖2）。

圖1 FUT1 基因PCR 擴增產物結果

2.3 生物信息學分析

2.3.1FUT1基因編碼蛋白理化性質FUT1基因編碼蛋白分子式為C4916H7548N1390O1353S46，共包含15 253 個原子，分子質量約為109 ku，理論等電點pI 為9.21。在組成FUT1蛋白的20種氨基酸中，Leu所占的比例最高（11.4%），Tyr 所占比例最低（1.7%）。根據Guruprasad 方法，FUT1 蛋白的不穩定指數為56.71，脂肪指數為75.23，說明FUT1 蛋白不穩定。

圖2 氨基酸變異位點

2.3.2FUT1基因編碼蛋白疏水性分析 FUT1 蛋白的1～30 位、700～780 位極具親水性（圖3）?？傮w看來，FUT1基因編碼蛋白是親水性蛋白。

2.3.3FUT1基因編碼蛋白跨膜分析FUT1基因編碼殘基的所有氨基酸都位于細胞膜表面，與蛋白的疏水性區域結果分析基本一致，表明該蛋白沒有跨膜結構（圖4）。

圖3 FUT1 基因編碼蛋白親水/疏水曲線

圖4 FUT1 基因編碼蛋白跨膜區預測結果

2.3.4FUT1基因編碼蛋白磷酸化位點分析 FUT1 編碼蛋白中發現58 個Ser、28 個Thr 和9 個Tyr 可能是磷酸化位點，真正的磷酸化位點還需要進一步通過試驗來確認（圖5）。

圖5 FUT1 基因編碼蛋白中磷酸化位點

2.3.5FUT1基因編碼蛋白糖基化位點分析 FUT1 蛋白進行糖基化位點預測結果發現3 個典型的N 糖基化位點，分別位于136、195、694 位（圖6）。

2.3.6FUT1基因編碼蛋白的信號肽分析FUT1基因編碼蛋白不具有信號肽結構（圖7 和圖8）。

2.3.7FUT1基因編碼蛋白二級結構預測FUT1基因編碼蛋白二級結構主要由α螺旋為主（圖9）。

2.3.8FUT1基因編碼蛋白超二級結構—結構域分析FUT1基因編碼蛋白第264～554 位是一個高度保守的結構功能域——Glyco_transf_11，該結構功能域具有結構分子活性。

圖6 FUT1 基因編碼蛋白中糖基化位點

圖7 FUT1 基因編碼蛋白基于神經網絡算法預測結果

圖8 FUT1 基因編碼蛋白基于HMM 算法預測結果

2.3.9FUT1基因編碼蛋白三級結構分析FUT1基因編碼蛋白的同源蛋白為c2hlhA，該蛋白屬于巖藻糖基轉移酶（Nodulation Fucosy Ltrans Ferase）家族成員。目標蛋白中有236 個殘基以100%的置信度建模。c2hlhA與提交的目的序列匹配性較好，預測準確度為100%，該折疊子的X 射線晶體衍射結構折疊識別出FUT1基因編碼蛋白三級結構（圖10）。

2.4 不同物種FUT1基因比較及其系統進化樹構建 從NCBI 數據庫中下載各物種FUT1基因序列。利用DNAMAN 8.0 軟件將迪慶藏豬分別與參考物種比對，結果顯示，迪慶藏豬與滇南小耳豬的同源性最高（99.8%），迪慶藏豬與人、小鼠、牛、黑猩猩、猴子、馬、狗、兔和中國樹鼩同源性分別為69.8%、59.4%、80.2%、69.5%、69.5%、79.3%、78.7%、67.2% 和70.2%（表2）。利用MAGE 8.0 軟件構建基因系統進化樹，發現迪慶藏豬與滇南小耳豬最先聚為一支，小鼠獨自為一支（圖11）。2 種分析結果均表明同一物種間親緣關系近，不同物種間親緣關系較遠，不同物種間迪慶藏豬與牛的同源性最高，小鼠最低。

3 討 論

遺傳性抗病力可以發揮機體免疫抗病系統及其相互作用等多方面遺傳潛力?？共∮N指利用現有的品種資源，通過常規或分子育種的方法，培育抗病力強的新品種（系），選擇培育具有體貌特征好、抗病力強、遺傳性能好、適應性強、抗逆性好的個體，經若干世代的選育，最終培育出抗病力強的新品種（系）[12]。腹瀉是最常見、嚴重的仔豬疾病之一，也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因，不但導致仔豬成活率降低，飼料報酬降低，生長發育停滯甚至形成僵豬，而且會降低仔豬免疫力，繼發感染其他疾病，影響經濟效益，威脅養豬業的健康發展。吳圣龍等[13-14]證實FUT1基因的M307 位點多態性與斷奶仔豬腹瀉和水腫病存在直接的相關性，且抗病性AA 基因型不僅對斷奶仔豬腹瀉具有抗性，并具有較高的一般抗病性。周利華等[15]對10 個國內外豬種FUT1基因新cSNPs 鑒別，并進行仔豬抗大腸桿菌F18侵染研究，結果發現M229C/T 和M714T/C 這2 個位點為錯義突變，其中M229 位點可能是決定中國地方豬水腫與腹瀉病的變異位點。本研究也發現迪慶藏豬FUT1基因存在7 個突變位點，其中有4 個錯義突變，包括已發現的C299T、A306G，以及新的C862G、C2418A，這或許與種質資源或遺傳進化相關。迪慶藏豬FUT1基因錯義突變影響相關編碼蛋白的結構與功能，可能導致迪慶藏豬產生耐嚴寒、抗逆性強等相關特性。

圖9 FUT1 基因編碼蛋白二級結構預測

圖10 FUT1 基因編碼蛋白三級結構分析

表2 不同物種FUT1 基因同源性比較

圖11 不同物種FUT1 基因進化樹

目前關于豬FUT1基因的研究主要集中在仔豬腹瀉和生長性能等方面[16-20]，生物信息學方面的研究尚未見報道。本研究結果發現，迪慶藏豬FUT1基因全長3 045 bp，共編碼987 個氨基酸，FUT1基因編碼蛋白是一個親水不穩定蛋白，沒有跨膜結構和信號肽結構。FUT1基因編碼蛋白二級結構主要由α螺旋為主，存在一個高度保守的結構功能域Glyco_transf_11，并具有結構分子活性。氨基酸在蛋白質內部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白質三級結構的形成和穩定中起著重要作用。三級結構分析目標蛋白中有236 個殘基以高置信度建模，c2hlhA 與目的序列匹配性較好，預測準確度高。從物種遺傳進化方面看，各物種FUT1基因序列各不相同。同一物種間迪慶藏豬FUT1基因與滇南小耳豬的同源性高達99.8%，但也存在差異，不同物種間FUT1基因突變差異較大，親緣關系遠，這可能與物種進化或自然環境有關。

4 結 論

迪慶藏豬FUT1基因共有7 個突變位點，其中4 個為錯義突變。在FUT1基因編碼蛋白結構方面，FUT1蛋白是一個親水性不穩定蛋白，不存在跨膜結構和信號肽結構，有95 個潛在的磷酸化位點和3 個N 糖基化位點，1 個高度保守的結構功能域Glyco_transf_11，同源蛋白c2hlhA 匹配性較好。在物種遺傳進化方面，迪慶藏豬與滇南小耳豬親緣關系近，與其他物種親緣關系遠。