復合氨基酸對斷奶仔豬背最長肌生長的影響

紀昌正 ，田俊杰，朱哲坤，王 倩，孟禹璇，李寶成，王 蕾,2，侯永清,2*

（1.武漢輕工大學動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學動物營養與飼料安全湖北省協同創新中心，湖北武漢 430023）

隨著我國畜牧業的快速發展以及人民生活水平的提高，人們對畜產品的要求也不斷提高，豬的瘦肉（肌肉）質量受到廣泛關注。功能性氨基酸對動物的生長和發育以及營養物質代謝等生命活動發揮著重要的生理作用[1]。谷氨酸（Glutamate，Glu）參與調控機體其他氨基酸的代謝，對動物的應激反應和免疫功能等方面起著重要作用，是動物最佳生長和健康所必需的一種氨基酸[2]。谷氨酰胺（Glutamine，Gln）可以促進血清蛋白的合成并提高肌肉組織的抗氧化能力[3]。精氨酸（Arginine，Arg）可促進機體蛋白質合成及抑制其降解，適宜的精氨酸需要量能夠促進新生仔豬的生長[4]。Powell 等[5]研究發現，甘氨酸（Glycine，Gly）能夠提高仔豬的日增重和飼料轉化率，對仔豬的生長發育起著重要的作用。另外，甘氨酸還是一種有效的抗氧化劑，可清除體內自由基，提高機體免疫力[6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對刺激引起的肌肉能量消耗具有緩解作用[7]。

功能性氨基酸作為合成多種具有重要功能生物活性分子的必需前體物，參與調節動物的新陳代謝途徑，對維持動物正常的生長、發育和繁殖都發揮著至關重要的作用[8]。國內外關于各種功能性氨基酸的報道已有很多，但將多種功能性氨基酸按一定比例制成復合物，對仔豬肌肉生長影響的相關報道還很少。前期研究表明，添加1.0% 復合氨基酸可顯著降低仔豬腹瀉率，對仔豬生長性能無顯著影響[9]。本試驗旨在研究復合氨基酸對仔豬背最長肌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用谷氨酸（G103978，99%）、谷氨酰胺（G105425，99%）、精氨酸（A108220，98%）、甘氨酸（A111465，≥99%）、N-乙酰半胱氨酸（A105420，99%）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品。

根據前期預試驗結果確定了復合氨基酸的組成和比例，即復合氨基酸按谷氨酸:谷氨酰胺:甘氨酸:精氨酸:N-乙酰半胱氨酸為5:2:2:1:0.5 的比例混合制成。

1.2 試驗動物與試驗設計 試驗選用16 頭24 日齡體重（5.49±0.35）kg、健康杜× 長× 大斷奶仔豬，隨機分為對照組和復合氨基酸組，每組8 個重復，每個重復1 頭豬。各組基礎日糧一致，對照組飼喂基礎日糧+0.99%的丙氨酸（等氮控制），復合氨基酸組飼喂基礎日糧+1.0%的復合氨基酸，試驗期為21 d。

1.3 試驗日糧 基礎日糧參照NRC（2012）豬的營養需要標準配制，日糧的組成及營養成分見表1。

表1 基礎日糧組成及營養成分（風干基礎）

1.4 飼養管理 豬舍為全封閉式，進豬前對豬舍及豬籠徹底清洗豬舍并消毒。仔豬飼養在不銹鋼試驗籠中，試驗期間保持豬舍通風良好，維持室溫在22～25℃；由鴨嘴式飲水器供水；每天飼喂5 次，分別在8:00、12:00、15:00、18:00、22:00 飼喂，保證自由采食，自由飲水；每天清掃豬舍1 次，每天用消毒液進行圈舍消毒。

1.5 樣品采集 于試驗第21 天，待所有仔豬完全麻醉后屠宰。將背部皮膚剖開，取中間段背最長肌，剪成小塊分裝在凍存管中，立即裝入紗布袋放入液氮中凍存，再轉至-80℃保存待測。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 背最長肌生長指標 用John Chandler 法[10]提取組織勻漿液中的DNA 和RNA，用紫外吸收法測定提取液中RNA 和DNA 水平?？偟鞍诇y定方法參照試劑（南京建成生物工程研究所）所附說明書。

1.6.2 背最長肌游離氨基酸含量 采用德國SYKAM S-433D 型氨基酸分析儀檢測背最長肌游離氨基酸含量。

1.6.3 背最長肌生長和氨基酸轉運載體相關基因相對表達量的檢測 采用TRIzo（lTaKaRa，大連）一步抽提法，提取背最長肌研磨樣品中的總RNA，在保證RNA 純度合格（A260/A280=1.7～2.1，且A260/A230＞2）且未降解的前提下，根據PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）試劑盒的方法步驟對RNA 進行反轉錄，合成cDNA，然后再采用實時熒光定量PCR（qPCR）的方法，以RPL4基因為內參進行檢測。各個基因qPCR 的數據結果統一參照Fu 等[11]的方法進行統計分析。檢測的基因序列見表2。

1.7 統計分析 數據采用SPSS 17.0 統計軟件進行單因素方差分析，結果用平均值± 標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，P＜0.1 為具有顯著性趨勢。

2 結果

2.1 復合氨基酸對背最長肌生長的影響 從表3 可以看出，與對照組相比，復合氨基酸組提高了背最長肌蛋白質含量和蛋白質/DNA（P＜0.05），降低了RNA/DNA（P＜0.05）；有降低RNA 含量的趨勢（P＜0.1），其他指標差異不顯著。

2.2 復合氨基酸對仔豬背最長肌游離氨基酸的影響 從表4 可以看出，與對照組相比，復合氨基酸組顯著提高了背最長肌纈氨酸、組氨酸、3-甲基組氨酸和精氨酸的含量（P＜0.05）；降低了背最長肌蘇氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、賴氨酸和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量（P＜0.05）；其他氨基酸含量差異不顯著。

表2 檢測基因的引物序列

表3 復合氨基酸對背最長肌生長的影響

2.3 復合氨基酸對背最長肌相關基因相對表達量的影響由表5 可知，與對照組相比，復合氨基酸組顯著上調了仔豬背最長肌PepT1和b0,+AT基因的相對表達量（P＜0.05），顯著下調了仔豬背最長肌MSTN基因的相對表達量（P＜0.05）；其他基因的相對表達量差異不顯著。

3 討 論

3.1 復合氨基酸對肌肉組織生長的影響 蛋白質是生命活動的重要承擔者，影響各種酶的合成、細胞生長等。DNA 濃度、RNA/DNA 比值和蛋白質/DNA 比值可以說明細胞的發育、代謝情況等，可用于評估肌肉生長情況[12]。DNA 濃度反映有絲分裂產生新的細胞的速度，RNA/DNA 比值可以衡量細胞的增長速率，蛋白質/DNA比值表示細胞中蛋白合成的效率[13-14]。本試驗結果表明，復合氨基酸組背最長肌蛋白質含量和蛋白質/DNA顯著升高，說明添加復合氨基酸可以促進背最長肌細胞的蛋白合成，代謝加快。大量研究表明，谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸和N-乙酰半胱氨酸可以通過mTOR 信號通路促進蛋白的合成，谷氨酸和精氨酸的代謝產物多胺對DNA 和蛋白的合成有重要作用[15-19]。這表明復合氨基酸對背最長肌的合成有促進作用。

表4 復合氨基酸對仔豬背最長肌游離氨基酸的影響

表5 復合氨基酸對背最長肌相關基因相對表達量的影響

3.2 復合氨基酸對背最長肌游離氨基酸含量的影響 本試驗研究發現，日糧中添加復合氨基酸顯著提高了背最長肌精氨酸水平，提示復合氨基酸可能會影響機體腎臟功能或蛋白質代謝。對仔豬來說，精氨酸是一種必需氨基酸，對動物的生長和免疫有重要作用[20]。研究表明，支鏈氨基酸中的纈氨酸是豬必需氨基酸，對機體代謝有著重要的生物學作用。纈氨酸是生長肥育豬肌肉蛋白質合成的必需氨基酸[21]。組氨酸是可以組成蛋白組結構的一種含有咪唑雜環的氨基酸，參與機體蛋白質合成，還是生理活性物質的成分，具有清除細胞內氧化物和參與免疫調節作用等[22]。本試驗研究表明，添加復合氨基酸可以提高背最長肌纈氨酸、組氨酸、3-甲基組氨酸的含量，表明復合氨基酸通過調節背最長肌氨基酸水平從而促進背最長肌的生長。

3.3 復合氨基酸對背最長肌生長及氨基酸轉運載體相關基因表達量的影響 本試驗研究表明，添加復合氨基酸顯著提高了背最長肌PepT1基因的相對表達量。Shiraga 等[23]的研究亦表明，日糧中二肽和游離氨基酸濃度增加，PepT1基因的轉錄活性增強，其對二肽的轉運活性增強，進而使PepT1在細胞膜上的表達增多。氨基酸轉運載體b0,+AT在氨基酸轉運吸收中有著重要作用。有研究表明，斷奶仔豬日糧中添加精氨酸，b0,+AT表達增加，小腸內精氨酸轉運吸收能力增強，從而對緩解仔豬斷奶應激和促進腸道黏膜修復起到一定作用[24]。本試驗研究結果顯示，添加復合氨基酸可顯著上調b0,+AT基因的表達量，說明復合氨基酸通過調節氨基酸代謝相關的基因表達促進背最長肌的氨基酸代謝，進而影響背最長肌的生長。肌肉生長抑制素（Myosmfin，MSTN）基因也稱GDF-8（Growth And Different-Tiation Factor 8）基因是轉化生長因子β超家族的成員，是骨骼肌生長的抑制因子[25]，它通過抑制MyoD家族成員轉錄活性來抑制肌細胞的生長發育，其表達量與肌肉重量的變化呈負相關[26]。本試驗研究結果顯示，添加復合氨基酸組仔豬背最長肌MSTN基因相對表達量顯著低于對照組，表明復合氨基酸通過降低肌肉生長抑制因子的表達促進背最長肌的生長。

4 結 論

復合氨基酸可以促進背最長肌蛋白質的合成，調節氨基酸代謝，抑制肌肉生長抑制因子的表達，對斷奶仔豬背最長肌的生長有促進作用。